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生长抑素联合生长激素治疗对重症急性胰腺炎大鼠脑损伤的保护作用(上)
hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-08-31 18:00:41
    [摘要]  目的  观察重症急性胰腺炎(SAP)时脑损伤与血清内皮素(ET)-1/一氧化氮(NO)比值的关系以及生长抑素和生长激素的保护作用。方法  80只大鼠经胰胆管逆行注射3.5％牛磺胆酸钠2.5ml／kg建立SAP模型，然后分成4组：重症胰腺炎组(SAP组)，生长抑素组(S组，每天静脉注射42μg／kg，共2d)，生长激素组(G组，每天皮下注射0.5 μg／kg，共2 d)和联合治疗组，每组20只。另取20只不造模大鼠为正常对照组。观察各组治疗前后脑水肿、血脑屏障、脑细胞凋亡变化以及与血清ET-1／NO的相关性。结果  SAP大鼠血清ET-1／NO显著升高，与脑水肿、血脑屏障损伤程度及脑细胞凋亡呈正相关。生长激素和生长抑素可降低血清ET-1／NO水平，减轻脑组织水肿，减少脑细胞凋亡，改善血脑屏障通透性。同时观察到SAP大鼠脑电图呈慢波改变，治疗后好转。结论  生长激素和生长抑素可降低SAy大鼠血清ET-1／NO比值，改善脑水肿和血脑屏障通透性，减少脑细胞凋亡，对SAP时的脑损伤有保护作用。
     [关键词]  重症急性胰腺炎；生长抑素；生长激素；脑损伤
    多器官功能衰竭是重症急性胰腺炎(SAP)的主要死亡原因，胰性脑病是SAP致死的原因之一，是近年来关注的热点问题。胰性脑病的发病机制仍不明确，本实验观察SAP大鼠血清内皮素(ET)-1/一氧化氮(NO)比值，脑水肿和血脑屏障以及脑电图改变，并观察应用生长抑素和生长激素联合治疗后的脑损伤情况。
    材料和方法
    一、材料
    1．动物：100只雄性SD大鼠(购自中国科学院)体重为(270±15)g，分为正常对照组、SAP组、生长抑素治疗组(S组)、生长激素治疗组(G组)和生长激素联合生长抑素治疗组(联合治疗组)共5组，每组20只。
    2．试剂：生长抑素(Stilamin)和生长激素(Saizen)为瑞土雪兰诺公司产品；牛磺胆酸、伊文蓝购自Sigma公司；TUNEL试剂盒购自Roch公司；二甲基甲酰胺购自华美公司。NO测定试剂Griess液由中国科学院上海生理研究所制备；ET-I免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。白细胞介素(IL)-6和肿瘤环死因子(TNF)α酶联免疫试剂盒购自美国T&B公司。
    3．仪器：采用图像分析系统(复日公司)，脑电图记录仪(Medelec)和流式细胞仪(Becton Dickinson)。
    二、实验方法
    1．SAP大鼠模型的建立：参照Kaplan等方法，在手术显微镜下，分离胰胆管进入十二指肠处3-5 mm，逆向穿刺胰胆管并注射3.5％牛磺胆酸钠2.5ml／kg，在4 kPa压力下缓慢推注。
    2．给药方法：造模后1 h，S组大鼠经股静脉穿刺注射生长抑素，每天42μg／kg，共2d；G组大鼠皮下注射生长激素，每天0.5μg／kg，共2d。联合治疗组大鼠给药为上述2种药物剂量总和。正常对照组注射生理盐水。
    3．NO和ET测定：给药后48 h，收集动物血标本置-20℃冰箱待测。NO用Griess法测定。ET测定：123**I-ET与标准品竞争性地与ET抗体结合，在丁计数器上测定抗原抗体复合物的cpm值，并以B／T计算NSB、S0结合百分率，绘制标准曲线，最后换算出样本浓度，单位为pg／ml。取上清液进行放射免疫测定，操作严格按放射免疫试剂盒说明，用非平衡法测定ET含量。血清IL-6和TNFα用ELISA法测定。
    4．脑电图检测(每组5只)：将电极针插入额骨及左右颞骨表面，采用双极导联，地线置于鼻尖。导联连接方式为左颞-额、额-右颞。对照组大鼠记录10min，治疗组及非治疗组大鼠连续记录5 min，并同时观察记录动物脑电图表现。记录参数：定标电压200／μV／cm，高频滤波50 Hz，低频滤波2 Hz，时间常数0.3 s，纸速30mm／s。
    5．脑含水量测定(每组5只)；造模后48h，取动物脑组织，称湿重后切片，置105℃烘箱24 h，称干重，测脑组织含水量，脑指数(BI)=(湿重-干重)／湿重。
    6．伊文蓝含量测定(每组5只)：先制作伊文蓝标准曲线。造模后48 h，动物经尾静脉注射2％伊文蓝(2 ml／kg)，15 min后处死，取右侧脑组织称湿重，匀浆后置二甲基甲酰胺45℃水浴48 h，取上清液在λ=63nm检测，根据标准曲线换算出伊文蓝的含量。
    7．脑细胞DNA细胞周期分析(每组5只)：动物于造模后48 h处死，取小块新鲜脑组织，机械法剪碎，200目尼龙滤网过滤成单细胞悬液，柠檬酸缓冲液固定1 h，经胰酶消化液处理，胰酶抑制酶中和后加碘化丙啶(PI)作用15 min，用流式细胞仪(中国科学院细胞所)进行细胞周期采样。
    8．TUNEL法原位检测凋亡细胞：大鼠经脑电图检查后处死，左心室灌注4％多聚甲醛固定，30％蔗糖沉淀后，常规石蜡包埋，切片6 μm。将切片置85℃烘箱30 min，经二甲苯和无水乙醇脱蜡和水化，含蛋白酶20 μg／ml的10 mmol／L Tris／HCl，37℃孵育30min，PBS冲洗2次；0.1％柠檬酸钠孵育2min，PBS冲洗2次；在样品上加5μl酶结合物和45l TUNEL反应液，将切片置湿盒中37℃孵育30min，PBS冲洗3次；磷酸甘油封片，在荧光显微镜下观察，摄影。
    9．数据统计：所有数据以x±s表示，组间比较均用SPSS软件包分析。
信息来源： 
 
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