[摘要]  目的  研究端粒酶在石棉诱发人胚肺成纤维细胞恶性转化中的作用。方法  将端粒酶基因功能片段(hTERT)导人人胚肺成纤维细胞(HELF)中。选用2.5μg／cm²温石棉粉尘分别对导人和未导人hTERT的HELF进行染毒，分离转化灶，观察细胞生物性状，测定细胞生长曲线、端粒酶活性和端粒长度，进行软琼脂集落形成实验，判定转化性质。结果  将hTERT成功导人HELF，建立了导人端粒酶功能片段的人胚肺成纤维细胞系(HELF-T⁺)。HELF和HELF-T⁺被石棉刺激后均发生了恶性转化，HELF-T⁺恶性转化率为(2.08±1.08)转化灶／皿，显著高于HELF染毒组的恶性转化率[(1.08±0.10)转化灶／皿]。恶性转化的细胞和HELF-T⁺均具有较高的端粒酶活性和较长的端粒长度。结论  端粒酶活性较高、端粒长度较长的细胞，经石棉刺激后恶性转化率也较高，表明端粒酶在石棉诱导细胞发生恶性转化的过程中发挥了重要作用。
    [关键词]  端粒，末端转移酶；端粒；石棉癌
    石棉是常见的职业危害因素和环境污染物。流行病学调查结果显示，长期接触石棉纤维的工人，肺癌和间皮瘤的发病率明显高于非接触人群。此外，胃肠癌、肝癌、喉癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤的发生也可能与石棉接触有关。1987年，国际癌症研究机构(IARC)根据流行病学、动物实验和遗传毒理学实验等方面的证据将石棉确定为人类致癌物。有研究结果显示，端粒酶在石棉诱发人类癌症中可能起着重要作用。我们应用基因导人法，将端粒酶功能片段(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)导人人胚肺成纤维细胞(human embryonic lungfibroblasts，HELF)，用石棉诱导HELF和导人hTERT的HELF(HELF-T⁺)恶性转化，研究端粒酶在石棉诱导人胚肺细胞恶性转化中的作用。
    材料与方法
    1．石棉纤维混悬液的制备：青海茫崖产温石棉(北京大学医学部馈赠)。将石棉纤维束切割成长度为5 txm的粉尘，分别用磷酸盐缓冲液(PDS)定容到所需浓度，高压灭菌，用前搅拌。
    2．细胞及其培养：PT67包装细胞系为(美国Clontech公司)。在小鼠双嗜性反转录病毒包装细胞系基础上改进而成，具双嗜性和长臂猿白血病病毒受体，有广谱的宿主感染性，且包装过程中无辅助病毒产生；NIH3T3细胞系购于中国医学科学院基础医学研究所，为Swiss小鼠胚胎永生化成纤维细胞。PT67和NIH3T3均用含10％无胎牛血清(FBS)、0.025 g／L硫酸庆大霉素的Dulbecco改良的基础培养基(DMEM)培养液，37℃、5％CO₂培养箱中培养。HELF细胞系购自中国疾病预防控制中心病毒学研究所诊断室，为双倍体正常人胚胎肺细胞，属成纤维细胞类，外观呈梭状，贴壁性生长，具接触抑制性，无复层生长，用含10％FBS及0.025 g／L硫酸庆大霉素的基础培养基培养液，37℃、5％CO₂培养箱中培养。DMEM、基础培养基干粉购自美国Gibco公司，按产品说明书配置成培养液，过滤消毒。
    3．hTERT基因导人HELF及鉴定分析：取10g／L质粒pBABE-HYGRO-hTERT 1 μl(美国Whitehead生物医学研究所Weinberg实验室馈赠) ^[1]、感受态大肠杆菌DH5α(北京博大泰克公司)100 μl，按文献^[2]的方法扩增和制备该质粒，并导人PT67包装细胞(美国Gibco公司)，制备具感染性并表达hTERT的逆转录病毒。以NIH3T3为靶细胞，加入不同稀释倍数的病毒液处理后，用含0.2 g／L潮霉素B的DMEM培养基筛选，直至出现细胞克隆，根据抗性克隆的数目和稀释度计算病毒滴度。将3-48 μl病毒液、4g／L聚凝胶2μl、1 ml含FBS的基础培养基感染HELF，3h后再加入含FBS的10％培养液继续培养48h，1：10传代后用高浓度选择性培养液(含潮霉素B 0.2 g／l)培养10 d，后改为低浓度选择性培养液(含潮霉素B 0.05 s／L)培养，挑选抗性克隆并分离扩大培养。使用端粒酶活性测定试剂盒(瑞士Roche公司)测定端粒酶活性。端粒长度测定采用端粒重复扩增(TRAP)法，收集细胞，提取DNA，按试剂盒说明书进行Southern杂交分析(瑞士Roche公司)。终浓度为0.04 mg／L的秋水仙胺培养细胞6 h，37℃、0.075 mol／L KCl低渗处理30min，新鲜固定液固定30 min，2次，制片后，Giemsa染色20min，二甲苯透明3次，中性树胶封片。油镜下观察，记录并进行显微摄像。最后进行剪贴，翻拍，分析核型。软琼脂集落形成实验按文献^[3]的方法操作。用倒置显微镜观察细胞形态，取生长状态良好的细胞，制成单个细胞悬液，调整细胞密度至5×10⁶／L，分别接种于培养板中，每孔2ml。每天对3孔细胞进行计数，计算均值。绘制细胞的生长曲线。
    4．石棉诱导HELF和HELF-T⁺性转化：石棉对HELF毒性测定采用噻唑蓝(MTF)比色法，在细胞中分别加入0-20 μg／cm²石棉培养液，形成剂量梯度，培养24h。采用二甲基亚砜处理后，在酶联免疫检测仪上于490nm波长测定各孔吸光度值，计算细胞存活率，用SAS软件包进行统计学分析。石棉诱导HELF和HELF-T⁺转化及鉴定选用MIT实验结果确定的适当浓度石棉培养液，给对数生长期的HELF和HELF-T⁺染毒24h，阴性对照组仅加入基础培养液。染毒处理后先用含FBS的10％基础培养液培养4周后，再改用含FBS的5％基础培养液继续培养。记录转化灶数并用SAS软件包进行统计学分析。用眼科镊取浸有胰蛋白酶消化液的小滤纸片覆盖于克隆表面，再将滤纸片分离的转化灶移人基础培养基中扩大培养。进行软琼脂集落形成实验，测定细胞生长曲线、端粒酶活性和端粒长度，方法同前。
    结果
    1．pBABE-HYGRO-hTERT质粒制备：用pBABE-HYGRO-hTERT质粒转化大肠杆菌DH50t，挑选2个菌落，少量扩增质粒后进行酶切鉴定。电泳结果显示，由2个菌落提取的质粒均被SalI和EcoRl2种酶切为2个片段，大片段长5.2 kb，为载体pBABE-HYGRO；小片段长3.5kb，为目的基因hTERT cDNA插入片段，证实提取的质粒中含有目的基因hTERT。 

    2．稳定转化PT67细胞的筛选：采用脂质体法以pBABE-HYGRO-hTERT转化PT67包装细胞，24h后以1：10传代，细胞继续培养24h。改用高浓度选择性培养基DMEM培养10d后细胞大量死亡，转化组仅剩少许细胞，换为低浓度的选择性培养基。1周后转化组开始出现细胞克隆，而对照组细胞全部死亡。
    3．病毒滴度测定：以NIH3T3为靶细胞测定hTERT逆转录病毒滴度，当病毒原液为0.05 ml时，抗性克隆数为83个，病毒滴度为1.66×10⁷U／L；病毒原液为0.10ml时，抗性克隆数为146个，病毒滴度为1.46×10⁷U／L。表明病毒感染靶细胞后，在相应的选择性培养基中，靶细胞能够形成抗性克隆，且抗性细胞克隆的数量与转染液中感染性病毒颗粒的浓度成正比，说明制备的逆转录病毒可供感染细胞用。
    4．hTERT逆转录病毒感染HELF的筛选及鉴定：用hTERT逆转录病毒感染HELF，用高浓度选择性培养液筛选感染细胞10d后细胞大量死亡，感染组仅剩少量细胞，改用低浓度选择性培养液筛选1周对照组细胞全部死亡，而感染组HELF出现抗性细胞。采用TRAP法测定感染前后HELF中的端粒酶活性，HELF-T⁺的相对端粒酶活性(76.6％)明显高于正常HELF(1.1％)，HELF-T⁺端粒酶活性呈阳性(AA为3.4)，HELF端粒酶活性呈阴性(AA为0.1)。Southern杂交结果显示，HELF-T⁺的端粒明显长于正常HELF，说明成功建立了端粒酶HELF模型。
    5．HELF-T⁺的生物学性状：扩大培养HELF-T⁺克隆，镜下观察可见HELF-T⁺形似梭状，单层生长，有方向性和接触抑制性，形态上与正常HELF无明显差别。将HELF-T⁺由高血清培养液转至低血清培养液中培养，发现细胞生长速度减慢，表明HELF-T⁺对血清具有依赖性。细胞生长曲线显示，HELF和HELF-T⁺的细胞生长速度变化规律相似，均在开始2d内生长缓慢，第3天进入对数生长期，第8天基本达到平台期。但HELF-T⁺的生长速度比HELF快。HELF在传至约45代时，细胞变得更为细长，且不断有细胞变圆、脱落和死亡，细胞生长速度也明显变慢，从2d传代1次延迟到约1周传代1次；而HELF-T⁺在传至50代时，形态和生长速度仍无明显改变，提示hTERT基因导人后细胞的寿命延长。以传至7代的HELF-T⁺进行核型分析，随机观察30个细胞的核型，未见染色体断裂、易位和缺失等现象，表明HELF-T⁺具备正常核型。将HELF和HELF-T⁺分别接种于0.3％的软琼脂中，培养3周后均未见细胞克隆形成。
    6．石棉对HELF毒性的测定：用MTT法测定不同剂量石棉的毒性，HELF的存活率显示，当石棉的染毒剂量增加时，HELF存活率均随之下降，经t检验和t′检验，其中1.25-20.0 μg／cm²组的细胞存活率与对照组比较均差异有非常显著性。
    7．细胞转化实验：根据MTF实验结果，确定用2.5 μg／cm²作为石棉刺激HELF和HELF-T⁺的染毒剂量。实验结果显示，石棉染毒过程中，HELF和HELF-T⁺染毒组细胞总数仍在不断增加，同时可见少量细胞脱落死亡。完全去除石棉纤维3 d后，各染毒组及对照组细胞均已长满。染毒结束后2个月，2种细胞染毒组均出现数目不等的转化灶。转化灶细胞呈短梭状或圆形，方向性消失，失去接触抑制，呈重叠、堆积生长。HELF和HELF-T⁺未染毒对照组均无转化灶出现，细胞呈单层生长，排列有序。HELF-T⁺染毒组转化率平均为(2.08±1.08)转化灶／皿，显著高于HELF染毒组的平均转化率(1.08±0.10)转化灶／皿，P<0.05。
    8．软琼脂集落形成实验：石棉转化后的HELF和HELF-T⁺均可在软琼脂中形成集落，对照组细胞无集落形成。
    9．端粒酶活性和端粒长度的测定：端粒酶活性测定结果显示，石棉诱导HELF恶性转化后，相对端粒酶活性比转化前(HELF)明显升高，而HELF-T⁺经石棉诱导恶性转化前后，相对端粒酶活性无明显变化。恶性转化后的HELF和HELF-T⁺中的相对端粒酶活性均明显高于HELF。2种细胞恶性转化后的端粒长度均比HELF明显延长，HELF-T⁺恶性转化后的端粒长度长于HELF恶性转化后。
    10．细胞生长速度：石棉诱导恶性转化的HELF-T⁺从第1天起就进入对数生长期，并保持快速的生长趋势，比HELF和HELF-T⁺的生长速度均明显加快。
    讨论
    本研究结果显示，HELF-T⁺的端粒酶活性升高，端粒长度及细胞寿命延长，这和以往在体外导人hTERT的结果相类似^[4]。本实验成功建立的hTERT基因导人人胚肺成纤维细胞系，不仅为本题端粒酶和石棉致癌机制的研究做好准备，也为其他环境与职业危害因素致病过程中端粒酶作用的研究提供了适用的细胞模型。
    综合软琼脂集落形成实验结果、细胞生物性状等多种指标，判断细胞是否发生恶性转化。hTERT导人HELF后可导致端粒酶激活，但不导致细胞恶性转化。经石棉刺激后，导人和未导人hTERT的细胞最终均可发生恶性转化，但导人hTERT的细胞(HELF-T⁺)恶性转化率明显高于HELF，差异具有统计学意义。说明端粒酶被激活后，协同石棉诱导的其他遗传学改变，使细胞更容易发生恶性转化，细胞趋于永生化。提示端粒酶在石棉诱导HELF恶性转化过程中发挥了重要作用。
    迄今，人们发现除少数细胞通过端粒异化延长机制合成端粒外，大多数细胞端粒的合成依赖于端粒酶^[5，6]。研究证实，端粒酶对细胞寿命起决定作用，是细胞衰老和永生化过程中的一个关键因素。对于绝大多数不具有端粒酶活性的体细胞而言，随着有丝分裂过程的逐代进行，端粒逐渐丢失，当缩短至一定程度时，即可启动阻止细胞分裂的信号，使细胞进入第1死亡期(M1期)，细胞开始衰老死亡。如果此时细胞被病毒转染或发生某些抑癌基因突变，细胞则可越过M1期继续分裂，端粒继续缩短，最终达到一个关键阈值，细胞进入第2死亡期，这时细胞会因为染色体形态异常和(或)端粒功能丧失等原因死亡。但极少数细胞会在此阶段激活端粒酶，使端粒的长度和功能得以恢复，避免死亡，并获得无限增殖的能力，成为永生化细胞。
    为了证实激活的端粒酶维持着癌细胞永生化的猜想，研究者采取不同手段抑制癌细胞端粒酶活性。结果发现，癌细胞失去维持端粒长度的能力，端粒逐渐缩短，癌细胞最终分裂停止、凋亡^[7，8]。此外，对儿童期成神经细胞瘤的研究结果也表明，没有或仅有非常低的端粒酶活性是肿瘤发生逆转的原因^[9]。
    在体外细胞恶性转化实验中发现，联合导人癌基因能够有效地使原代啮齿动物细胞转变为肿瘤细胞，而相似的实验在人细胞始终难以取得成功。直至Weinberg实验室将hTERT、大T抗原和ras基因联合导人人细胞才首次模拟出人细胞的癌变过程^[10]。这不仅证明了端粒酶在人细胞癌变中起着重要的作用，还表明端粒酶在人和啮齿类动物细胞癌变过程中的作用是不同的。因此，在人类的系统中研究端粒酶在癌症发生过程中的作用是啮齿动物模型研究所不能替代的。
    我们应用基因导人技术，在人的系统发现端粒酶激活在石棉诱导人类细胞发生恶性转化的过程中发挥重要作用，是石棉诱发癌症过程中重要的分子改变。hc360慧聪网医疗器械行业频道  慧聪医疗器械  医疗器械  医疗设备 手术器械 保健器材 卫生材料