[摘要] 目的 探讨铅对海马神经细胞生长发育和对Ⅱ型POU域蛋白Oct-2表达的影响。方法 采用大鼠海马神经细胞体外培养建立细胞模型，醋酸铅的染毒浓度分别为10-1、100、101、102、103μmol／L，对照组给予等量培养液。染毒后24h用免疫组织化学法检测神经细胞和神经胶质细胞的标志物神经丝(NF)和神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)以及Oct-2蛋白的表达。结果10μmol／L及以上浓度醋酸铅组海马神经细胞胞体减小、轴突突起长度和细胞间连接减少。CFAP免疫组化结果发现1 μmol／L醋酸铅即可使GFAP阳性细胞数明显增加，与对照组相比差异具有统计学意义。此外，1 μmol／L的醋酸铅可导致神经元和神经胶质细胞Oct-2表达阳性面积比与对照组相比差异具有统计学意义，10μmol／L以上浓度醋酸铅作用下，Oct-2表达阳性面积比和吸光度均高于对照组，差异具有统计学意义。结论 醋酸铅在抑制神经元生长和分化的同时可刺激神经胶质细胞增生，铅对中枢神经系统的部分毒作用至少与其导致的Oct-2表达增加有关。
[关键词] 铅；海马；神经元；神经微丝蛋白质类；同源域蛋白质类；大鼠
最初发现POU域蛋白转录因子家族是基于Pit-1，Oct-1，Unc86 3种蛋白的结构中都有一段约150-160个氨基酸的相似结构，其中包含有特异的DNA结合域和POU域同源盒，故取每种蛋白的首字母将其命名为POU域蛋白[1]。Oct-2为POU域蛋白的第Ⅱ亚类，首先发现于B淋巴细胞中，可调控免疫应答基因表达。随后的研究表明Oct-2在B淋巴细胞中的功能可被代替而并非必不可少，但在中枢神经系统的发育和成熟过程中却发挥极为重要的调控基因表达的作用[2]。
重金属铅是重要的工业和环境污染物，可严重影响人类的感觉、认知和学习记忆功能，并且处于发育过程中的中枢神经系统对铅毒作用更为敏感[3]。但迄今为止，有关铅神经毒作用机制仍未阐明。本研究旨在探讨铅对体外培养的海马神经细胞生长和Oct-2表达的影响，为阐明其神经毒作用机制提供科学依据。
材料与方法
一、材料和仪器
胎牛血清、达克培养基(DMEM)／F12、DMEM、B27型人类白细胞抗原(B27)和二羟乙基呱嗪乙烷磺酸(Hepes)缓冲液购自美国Gibco公司；胰蛋白酶；L-多聚赖氨酸，谷氨酰胺购自美国Sigma公司；兔抗Oct-2，羊抗神经丝抗体(NF-L)购自美国SantaCruz公司，兔抗神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrill aryacidic protein，GFAP)抗体，生物素化兔抗羊，生物素化羊抗兔，辣根过氧化物酶标记链霉卵白素购自北京中山生物制品公司；其他试剂为国产分析纯。24孔细胞培养板(日本Evergreen公司)；COa培养箱(美国Shel公司)；倒置显微镜(重庆光学仪器公司)；Nikon-UFX照相机(日本Nikon公司)；图像分析系统(MPIAS-500)。
二、方法
1．海马神经细胞体外培养及染毒：将怀孕第18天SD大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)脱颈处死，在无菌条件下开腹取出子宫，磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗3次。剪开羊膜后切取胎头，解剖镜下分离出双侧海马组织，加入汉克斯平衡盐水(HBSS)，用眼科剪剪碎组织。将海马碎块移人试管，HBSS洗2次，弃洗液。加入0.125％胰蛋白酶，置37℃培养箱中消化，其间摇动3次，15min后加入含10％胎牛血清的DMEM／F12中止消化，用吸管吹打使细胞分散。过150目筛，收集滤液，仍用上述培养液清洗细胞2次，1100r／min离心5 min，弃上清。加入2 ml DMEM全培养液(10％胎牛血清，2％B27，5 g／L葡萄糖，0.5 mmol／L谷氨酰胺，100mU／L胰岛素，15 mmol／LHepes，100U／ml青霉素，100μg／ml链霉素)，重新悬浮细胞，锥虫蓝染色后进行细胞计数，根据计数结果调整细胞浓度为5×105个／ml，接种于24孔培养板，孔板中预先放置有经多聚赖氨酸处理的盖玻片。将细胞置37℃、5％CO2培养箱中培养。接种当天为第1天，每48 h半量更换培养液1次，每天观察记录培养细胞的生长状况。培养第5天时加入阿糖胞苷，终浓度为10 μmol／L，以抑制神经胶质细胞的过度增殖，24 h后更换全部培养液，同时进行细胞染铅。分别向培养孔内加入醋酸铅溶液使其终浓度分别为10-1、100、101、102、103μmol／L，另设对照组给予等量培养液。
2．NF、GFAP和Oct-2免疫组织化学检测与分析染铅24h后取出24孔内盖玻片，每项指标2片，用PBS洗5 min×2，随后4％多聚甲醛室温下固定60min，PBS洗净固定液。按以下步骤进行免疫组化染色：(1)37℃下0.75％H202作用30 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗5 min×3；(2)马血清封闭，37℃下30min；(3)弃血清不洗，分别加入一抗：羊抗NF-L(1：400)，兔抗GFAP(1：200)，兔抗Oct-2(1：400)，4℃过夜；(4)分别加入生物素化兔抗羊和生物素化羊抗兔(1：200)，37℃下30 min；(5)辣根过氧化物酶标记链霉卵白素(1：200)37℃下30min；(6)二氨基联苯胺(DAB)显色；(7)脱水、透明、封固。各步骤间均用PBS冲洗5min×3。各样本玻片先行镜检照相，神经丝(NF)样本每片观察10个视野，计算每视野神经元数目，用目镜显微量尺直接在镜下测量神经细胞胞体最短直径和轴突突起长度，结果进行t检验；GFAP样本每片检查10个视野，计算每个视野阳性细胞数，t检验分析结果；利用图像分析系统测定Oct-2样片阳性面积比(Aa％)和吸光度值(A)，每组测定2张片子，每片测4个视窗，对测定结果进行t检验。
结果
1．海马神经元形态：海马神经元培养1 h时可见细胞分散单一，少有聚集成团的现象，细胞呈圆形，胞体发亮，周边可见明显光晕。2 h后，可见少数细胞开始贴壁，贴壁细胞呈圆形，直径6-10 μm。另可见个别细胞长出1或2个粗短突起。4h后突起细胞数增多，细胞突起长度也逐渐延长。24 h后绝大部分细胞贴壁，突起延长，并开始互相连接，胞体中部较暗，光晕明显。培养3 d后，神经细胞突起进一步增多并延长，分支交错形成明显的网络。海马神经细胞以多极神经元最为多见，胞体呈三角形或椭圆形，体积较大，有多个突起；也可见有一定数量的双极和单极神经元，细胞呈椭圆形。培养5 d时，神经元胞体逐渐增大，呈锥体状、卵圆状或梭状等形态，神经网络变得稠密。背景可见大而扁平状无突起的胶质、成纤维细胞。
2．铅对培养海马神经细胞的影响：染铅24 h后，NF免疫组化染色结果可见，抗NF阳性反应颗粒棕染，主要集中于神经突起，不同浓度铅对NF阳性细胞数、神经元胞体大小和突起长度的影响。10 μmol／L及以上浓度醋酸铅组海马神经细胞胞体减小和轴突突起长度减少，与对照组相比有统计学意义(P<0.05和P<0.01)，同时镜下也可见到这些组细胞树突分支和细胞间连接明显比对照组减少。100 μmol／L以上醋酸铅可显著降低神经元个数，与对照组相比P<0.01。
3．对海马神经胶质细胞的影响：GFAP阳性细胞即为神经胶质细胞，镜下见GFAP阳性反应产物棕染，状似蜘蛛。不同浓度醋酸铅作用下GFAP阳性细胞数的变化，结果表明，1 μmol／L醋酸铅即可使GFAP阳性细胞数明显增加，与对照组相比差异具有统计学意义，P<0.05。随着醋酸铅浓度的升高，GFAP阳性细胞数进一步增加，但在醋酸铅浓度达到1000 μmol／L时上升趋势不再延续。
4．醋酸铅对海马神经细胞Oct-2表达的影响：镜下见对照组Oct-2在神经元和神经胶质细胞均有一定程度的表达，主要见于胞核。1 μmol／L的醋酸铅导致神经元和神经胶质细胞Oct-2阳性面积比与对照组相比增大(P<0.05)，10 μmol／L以上浓度醋酸铅作用下，Oct-2表达的范围和强度均高于对照组(P<0.01)。为100μmol／L醋酸铅所致Oct-2表达增强。
我们采用体外培养方法研究不同浓度醋酸铅对培养海马神经细胞生长以及对Oct-2表达的影响。结果表明，染毒前的接种第5-6天时培养海马神经细胞生长状况良好，神经细胞和神经胶质细胞生长旺盛，神经突起延长并已交织成网状。由于培养神经细胞一般在2周左右达到生长顶峰，故选取神经细胞生长处于上升阶段的接种后第6天进行染铅。
神经丝是一种神经细胞特异性中间丝，为神经元的主要骨架成分，主要存在于神经细胞轴突，可表达神经丝蛋白的细胞即为神经细胞[4]。本研究结果显示，染铅后24h，10 μmol／L及以上浓度醋酸铅组海马神经细胞胞体减小、轴突突起长度和细胞间连接减少。前已叙及本实验期的神经细胞处于快速生长期，因此，细胞胞体减小和轴突突起长度减少反映了铅对神经元生长和突起延长的抑制作用，换言之，铅抑制了海马神经细胞的分化。在神经元的生长和分化过程中有多种基因表达产物是不可或缺的，其中编码神经丝基因的激活表达对于神经细胞出芽和突起生长延长是必需的[5]。铅对第Ⅳ亚类POU域转录因子Brn-3a表达的抑制(另文报道)从而导致神经丝转录受抑可能是铅抑制神经细胞分化的主要原因之一。另外，NF免疫组化结果还发现100 μmol／L以上醋酸铅显著降低神经元个数，这可能是铅导致神经细胞分化减少和死亡(坏死或凋亡)综合作用的结果。
GFAP主要分布于星形胶质细胞，是该种细胞的标志物，我们还发现1~moNL醋酸铅使得GFAP阳性细胞数明显增加，这进一步证实了铅不但抑制神经元的生长和分化，同时也对神经胶质细胞产生不良影响。Selvin-Testa等[6]研究发现铅可诱导出生后7d大鼠海马组织GFAP表达增加，随后的研究证实GFAPmRNA水平升高是其表达增加的原因，也即铅促进GFAP表达增加是通过基因转录途径。GFAP转录和表达增加的后果既可引起神经胶质增生(胶质细胞数相对稳定)，也可引起神经胶质细胞增生，本研究的结果支持后一种可能。造成神经胶质细胞数目发生改变的原因是，铅刺激星形胶质细胞的成熟和促进神经前体细胞向星形胶质细胞的分化[7]。Holtzman等[8]认为神经胶质细胞在铅神经毒性中发挥重要的保护作用，即在铅作用下，神经胶质细胞内可形成所谓包含体，将进入细胞的铅包容其中以防止铅对其他细．胞器的损伤，故铅所致神经胶质细胞增生实为机体的一项保护或应激措施。
POU同源域蛋白是一类DNA结合蛋白，共有6个亚类，可特异地识别和结合DNA，调控下游基因表达。Oct-2属第Ⅱ亚类POU域蛋白，首先在淋巴细胞中发现可促进免疫球蛋白基因表达。与在淋巴细胞中不同，研究结果表明Oct-2在神经细胞中主要通过与其调控的基因启动子结合发挥转录抑制作用，如抑制编码SNAP-25和synapsin I以及酪氨酸羟化酶的基因转录[9,10]。本研究结果显示1μmol/L的醋酸铅导致神经元和神经胶质细胞Oct-2阳性面积比与对照组相比显著上升，10μmol/L以上浓度醋酸铅作用下，Oct-2表达的范围和强度均显著高于对照组。由于Oct-2的抑制基因转录作用，铅所致Oct-2表达增加将会导致SNAP-25和synapsinI的转录降低。已知SNAP-25和synapsin Ⅰ是神经突触囊泡组成成分，参与对突触囊泡循环的调节[11]，故铅暴露可通过Oct-2的作用而影响神经细胞突触的正常结构和功能，神经细胞间的连接和信息传递也必然因此受到影响。另外，Oct-2还可抑制酪氨酸羟化酶的表达，由于酪氨酸羟化酶是儿茶酚胺神经递质合成的限速酶，它使酪氨酸羟化生成多巴进而脱羧生成多巴胺，因此铅所致Oct-2表达增加可能是铅影响脑组织多巴胺能神经元正常功能[12]的原因之一。hc360慧聪网医疗器械行业频道 慧聪医疗器械 医疗器械 医疗设备 手术器械 保健器材 卫生材料
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