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携TGFβl正、反义基因载体对膀胱癌细胞体外生长的作用

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-07-28 23:11:12

[摘要] 目的：探讨表达TGFβl正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体，对人膀胱癌细胞生长及细胞周期调控的作用：方法：以逆转录病毒pRevTRE为载体，构建表达TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体pRevTβ和pRevTβ-AS；分别转染膀胱癌细胞株EJ，观察不同载体对膀胱癌细胞体外增殖、克隆形成和细胞周期时相的影响。结果：pRevTβ、pRevTβ-AS载体病毒滴度分别为0.84、0.88 ×10⁵CFU／ml，对EJ细胞的整合率为100％，并有效表达；抑制TGFβl表达可以降低靶细胞的生长速度和克隆形成率，同时出现G₀／G₁期细胞比例增高和S期细胞比例降低：结论：携TGFβl反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体可以下凋EJ细胞内源性TGFβl表达，诱导肿瘤细胞G₁期阻滞，抑制肿瘤细胞体外生长增殖。 [关键词] TGFβl；复制缺陷型逆转录病毒载体；反义RNA；膀胱癌；培养的肿瘤细胞；细胞周期转化生长因子β1(transforming growth Factorβ1，TCFβl)是机体功能复杂的细胞因子，在许多生理、病理过程中发挥关键性调控作用^[1]。TCFβl是上皮细胞生长的抑制因子。然而，组织学研究证实，TCFβl在许多类型肿瘤，特别是恶性上皮性肿瘤中过度表达，通过直接或间接作用参与肿瘤细胞的恶性转化、肿瘤血管形成和细胞外基质形成，尤其是作为机体抗肿瘤免疫反应的重要抑制因子，与肿瘤发生，发展和不良预后有密切关系。膀胱癌组织TCFβl表达阳性率可达100%，其mRNA和蛋白表达水平升高与肿瘤分化程度和浸润性生长有明显关系、我们的前期研究结果亦表明，TCPβl异常表达与膀胱癌术后复发、转移和增殖活性呈正相关^[2]。本研究将携TCFβl正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体分别转染膀胱癌细胞系EJ，观察不同的重组载体对膀胱癌细胞周期调控和体外生长的影响作用，为以TGFβl为靶基因的肿瘤基因治疗研究和临床应用提供实验依据。材料和方法表达正、反义TGFβ1的复制缺陷型逆转录病毒载体的包装与滴度测定携TGFβl正、反义基因的逆转录病毒载体pRevTβ和pRevTβ-AS由本研究小组构建^[3]，逆转录病毒载体pRevTRE(CLONTECH公司)，均含抗潮霉素基因，依照常规Lipofectamine(GIBCO.BRL公司)介导转染方法，分别转染包装细胞PA317，以200μg/ml潮霉素(GIBCO.BRL公司)选择性培养，挑选抗性克隆并扩增。收获培养上清液，按常规方法感染NIH3T3细胞，测定上清液中逆转录病毒的滴度。二 EJ细胞病毒载体转染效率评价膀胱癌细胞株EJ(北京泌尿外科研究所丁毅博士惠赠)接种于6孔板中培养至70％-80％融合，分别加入10⁴CFU的复制缺陷型逆转录病毒载体pRevTRE、pRevTβ、pRevTβ-AS，潮霉素筛选抗性克隆扩增培养。提取基因组DNA，以其为模板与Hyg^r基因特异引物：上游：5 TCT CGT GCT TTC AGC TTC GAT 3：下游：5 GCA TCA GCT CAT CGA GAG CCT 3，行PCR扩增。以HindlIL／ClaI酶切基因组DNA 4小时，电泳后按常规方法，以生物素标记的TGFβl寡核苷酸5(Biotin)-GCA GCT GTA CAT TGA CTTCCG CAA GGA CCT-3(TaKaRa公司合成)为探针，行Southern-blot分析。Trizol Reagent抽提细胞总RNA，选择适宜的扩增循环数，根据文献方法^[2]行半定量RT-PCR反应，产物电泳、EB染色后，Kodak440凝胶成像系统进行灰度密度分析。以β-actin为内参照，EJ细胞TGFβlmRNA为标准参照，假设其含量为l，判定转染细胞TGFβlmRNA相对含量。取l×10⁵对数生长期细胞接种于24孔板，依文献ELISA方法，通过TECAN连续可调微孔分光光度计定量检测TGFβl蛋白浓度^[4]。三细胞体外生长曲线及克隆形成实验取对数生长期细胞，以2％FBS分别稀释细胞至1×lO⁵／ml，依文献方法绘制细胞生长曲线^[5]。计数100个细胞重悬于10ml的2％FBS培养液中，37℃培养10天，甲醛固定，姬姆萨染色20分钟，冲洗染色液，镜下计数各平皿克隆数，即为克隆形成率。四流式细胞仪检测细胞周期时相离心沉淀10⁶个对数生长期细胞，加入1 ml 75％乙醇，吹打为单细胞悬液，4℃温育24小时，PBS洗涤2次，加入lml染色液(含20μml PI，50μg/ml RNase的PBS溶液)，室温温育30分钟，流式细胞仪检测细胞周统计处理 SPSS1O.0软件进行数据分析。结果一复制缺陷型逆转录病毒载体滴度测定结果病毒载体转染的PA317细胞培养上清液0.1μl感染NIH3T3细胞，无阳性克隆出现；10μl以上均有Hyg^r细胞克隆出现，以最高稀释倍数10³为标准计算病毒滴度，pRevTRE、pRevTβ，pRevTβ-AS的最高滴度为1.17×10⁵、0.84×10⁵、0.88×10⁵CFU／ml。二载体病毒转染细胞效率 EJ、EJ-pRey，EJ-pRevTβ和EJ-pRevTβ-AS细胞基因组DNA经HindlII／ClaI酶切后，TGFpl寡核苷酸探针杂交显示，4种细胞均有4 kb左右的内源性杂交信号，而EJ-pRevTβ和EJ-pRevTβ-AS还有0.4 kb大小的外源杂交带，证明外源性TGFβl正、反义基因已被整合到细胞基因组中。EJ-pReV、EJ-pRevTβ和EJ-pRevTβ-AS细胞基因组DNA经Hyg^r特异引物均扩增出447 bp条带。表明载体病毒与靶细胞基因组的整合率为100％。半定量RT-PCR结果，与KJ和EJ-pRey细胞比较，EJ-pRevTβ细胞TGFβ1mRNA转录水平和培养上清中蛋白分泌水平上调；而EJ-pRevTβ-AS细胞TGFβl mRNA转录水平和蛋白浓度明显低于对照组细胞。携TGFβl正、反义基因的逆转录病毒载体可以分别有效地增加或抑制靶细胞mRNA转录和蛋白表达，而空载体对细胞TGFβl表达无明显影响、细胞增殖生长力判定 EJprev细胞生长速度比EJ略低，估计系逆转录病毒转染对细胞影响所致；EJ-pRevTβ-AS细胞生长速度明显减慢，表明pRevTβ-AS可以特异性降低EJ细胞的生长速度。EJ、EJ-pRev、EJ-pRevTβ和EJ-pRevTβ-AS细胞克隆形成率分别为33.8±6.5、30.5±4.5、39.6±8.8和11.3±4.7。结果说明转染pRevTRE本身对EJ细胞的克隆形成无明显影响，EJ-pRevTβ细胞克隆形成率高于EJ细胞，且差异具有显著性(F=5.14，P<0.05)；而反义TGFβl使EJ细胞增殖能力减弱，群体依赖性增强(F=51.30，P<0.001)。四 FCM检测体外培养细胞周期时相 EJ-pRevTβ-AS细胞S期比例为20.5％，低于EJ、EJ-pRev和EJ-pRevTβ(36.0％，34.7％和38.8％)；而前者的G₀／G₁期细胞比例为65.7％高于EJ、RJ-pRev和EJ-pRevTβ(49.4％、51.2％和45.6％)，表明反义TGFβl具有阻滞细胞C¹-S期转换的作用。讨论 TGFβl在很多肿瘤组织中过度表达。TGFβ1是重要的免疫抑制因子，同时通过诱导多种与肿瘤细胞周期调控、血管形成、细胞粘附迁移相关的基因表达，促进肿瘤发生发展，可能成为治疗恶性肿瘤的有效靶基因^[6]。反义RNA是一种能与靶基因mRNA特异互补结合，并抑制靶基因功能的小片段RNA^[7]。通过反义技术抑制肿瘤细胞中TGFβl表达，是研究内源性TGFβl作用机理的直接有效的方法，同时也是以TGFβl为靶基因治疗恶性肿瘤的必由之路。现在还没有指导真核细胞有效反义RNA设计的理论，无论针对靶mRNA5'端翻译启始区、5'端非编码区、3'端编码区反义RNA的抑制效果，都很难预测，只有通过实验证实。Moroni等^[8]通过观察与EGFRcDNA 3'端560bp、5'端890 bp及全长4.1kb序列互补的反义RNA对人上皮癌细胞系KB的生长抑制作用，发现与3'端互补的反义RNA能更有效抑制EGFR基因表达。几乎所有细胞分泌的TGFl31，都是由其cDNA编码的390氨基酸的前体蛋白，并无生物学活性。TGFβl活性蛋白是由3'端编码序列翻译的112氨基酸通过9对半胱氨酸连接形成的二聚体。文献报道的TGFβl表达载体，绝大多数以TGFβl全长序列为插入基因，由于受体内复杂的细胞环境的影响，表达效果各不相同，往往不能产生预期的生物学作用，Arrick等^[9]通过转染编码TGFβl活性肽序列和cDNA全长基因的表达载体，体内实验证实只有活性肽基因表达载体可以促进小鼠肿瘤的形成。基于上述研究，我们设计了与TGF-31cDNA3'端活性肽编码序列匹配的PCR引物，利用平末端连接不定向随机插入的特点，结合T₄DNA连接酶能够在高浓度条件下连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子的特性，通过一次连接反应，同时获得TGFβl正、反义表达载体。通过脂质体介导PA317细胞包装，经NIH3T3检测包装细胞上清液中的重组病毒滴度接近10⁵CFU／ml，能满足各种细胞体外转染需要。 TGFβl与细胞周期调控有密切关系。TGFβl是正常上皮细胞生长抑制因子，然而外源性TGFβ1非但不能抑制肿瘤细胞生长，相反可以促进细胞恶性增殖。选择高表达TGFβl基因的膀胱移行细胞癌细胞系EJ为靶细胞，观察正、反义TGFβI载体对其体外生长的影响作用。体外实验发现，抑制EJ细胞TGFβl表达，可以降低细胞生长速度和克隆形成率。说明抑制内源性TGFβl表达可以降低膀胱癌细胞体外生长增殖的活性。通过对转染后EJ细胞周期时相分析，我们发现反义TGFβl载体抑制KJ细胞增殖的作用表现为，S期细胞比例减少和G₁期细胞增多，引起G₁-S期阻滞。说明TGFβl调节位点在G₁期，具有促进EJ细胞通过细胞自我复制起点(restriction point)，进入细胞分裂周期的作用。近年研究发现，TGFβl是Ras／MAPK信号传导通路的上游调控基因，其对肿瘤细胞周期的正向调节作用与Ras／MAPK激活有直接关系^[10]。Park等^[11]研究证实，外源性TGFβl蛋白可以促进前列腺癌TSU-Prl细胞G₁-S期转换，转染H-Ras反义RNA抑制Ras基因表达或通过MAPK激酶l抑制物PD98059阻断MAPK途径，可以恢复TGFβl对细胞生长的抑制作用，膀胱癌中p21^Ras。表达率高^[12]，EJ细胞表达H-Ras基因，Ras／MAPK通路可能是TGFβl促进膀胱癌细胞增殖的重要通路。本研究表明，内源性TGFβl具有促进膀胱癌细胞体外生长增殖的活性，结合其促进肿瘤细胞外间质形成、肿瘤血管形成及抑制机体抗肿瘤免疫反应等方面的作用，可以认定TGFβl是膀胱癌基因治疗的理想靶基因。转染含TGFβl反义RNA的复制缺陷型逆转录病毒载体，是控制膀胱移行细胞癌恶性生长的一种潜在有效的治疗手段。hc360慧聪网医疗器械行业频道慧聪医疗器械医疗器械医疗设备 CT B超
信息来源：李文录赵秀英朱锡真等


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