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乙型肝炎病毒宫内感染机理的研究

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-09-17 22:24:58

[摘要] 目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染的可能机理。方法应用PCR技术检测59例乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性孕妇的羊水、阴道分泌物及其新生儿脐血清中HBV DNA(研究组)，10例乙型肝炎病毒标志物(HBVM)阴性的正常孕妇及其新生儿为对照组。采用免疫组化ABC染色法检测两组孕妇胎盘组织中的HBsAg及乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的阳性率。结果 (1)研究组孕妇的羊水、阴道分泌物、新生儿脐血清中HBVDNA阳性率分别为47.5％(28／59)、52.5％(31／59)、45.8％(27／59)；对照组孕妇的羊水、阴道分泌物、新生儿脐血清中均未检出HBVDNA。(2)研究组孕妇胎盘组织中HBsAg及HBcAg的阳性率，呈现出由蜕膜细胞(76.3％及59.3％)、滋养层细胞(72.9％及55.9％)、绒毛间质细胞(62.7％及50.8％)至绒毛毛细血管内皮细胞(52.5％及44.1％)依次递减的趋势；但其中有4例孕妇胎盘组织中HBsAg及HBcAg的分布与上述特点相反。研究组孕妇有32例羊膜细胞中检出HBs Ag及HBcAg。对照组孕妇胎盘组织中的HBsAg及HBcAg检出率为零。结论孕妇血中HBV主要是通过感染胎盘导致胎儿感染；但也可能存在胎盘以外的感染途径。 [关键词] 肝炎，乙型；疾病传播，垂直乙型肝炎病毒(HBV)感染，是一个世界性公共卫生问题，我国地处乙型肝炎高发地区，人群中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性率高达10％以上。近年来研究表明，HBV宫内感染是HBV的主要传播途径，是造成我国人群中存在大量HBV携带者的主要原因。但目前对宫内感染的机制尚无全面系统的研究。本研究采用PCR技术检测HBaAs阳性孕妇的羊水、阴道分泌物及其新生儿脐血中HBVDNA，并用免疫组化检测其胎盘组织中HBsAg和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的分布状况，旨在探讨HBV宫内感染的可能机理。资料与方法一、研究对象为广东省肇庆市妇幼保健院产科1997年10月至1999年3月足月分娩的孕妇及其新生儿，所有孕妇在门诊按期检查，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测HBV血清标志物(HBVM)。研究组为HBsAg阳性孕妇及其新生儿(59例)；对照组为HBVM阴性的正常孕妇及其新生儿(10例)。所选病例无先兆流产或先兆早产史，无妊娠合并症及并发症，两组孕妇年龄、孕产次及分娩时胎龄比较，差异无显著性(P>0.05)。二、研究方法 1．PCR检测HBVDNA：孕妇人院后未破膜前，扩开阴道，用棉拭子取阴道分泌物放人装有2ml生理盐水试管中；进入产程后，适时或刚破膜时，抽取羊水，避免血污染；胎儿娩出后于近胎儿端抽脐血3ml，分离血清。所有标本均-20℃保存，统一检测HBV DNA。HBV DNA的PCR检测试剂盒由华美生物工程公司提供，试验严格按说明操作。 2．免疫组化ABC染色法检测胎盘组织中HBsAg及HBcAg：胎盘娩出后于30min内分别取胎盘胎儿面及母体面组织约1 cm×l cm×2cm大小，用10％甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，进行5μm切片。免疫组化所用兔抗HBcAg，小鼠抗HBsAg，染色试剂盒及DAB显色药盒均购自武汉博士得生物工程有限公司。每次染色均有用HBsAg阳性和HBcAg阳性尸体肝脏组织做阳性对照，以HBVM均阴性的足月产胎盘组织做阴性对照，同时设PBS代替一抗空白对照。以细胞浆或细胞核中深棕黄色为强阳性染色，中等棕黄色为阳性染色，浅棕黄色为弱阳性染色。三、宫内感染的诊断新生儿脐血清HBV DNA阳性诊断为宫内感染。结果一、两组孕妇羊水、阴道分泌物及新生儿脐血清HBV DNA阳性率比较研究组孕妇羊水、阴道分泌物、新生儿脐血清中均检测出HBV DNA；而对照组孕妇的相应组织中均未检测出HBV DNA。二、两组孕妇胎盘组织中HBsAg与HBcAg阳性率比较 (1)研究组孕妇胎盘组织HBsAg阳性率为81.4％(48／59)，HBcAg阳性率为61.0％(36／59)。胎盘组织中HBsAg呈不均一的棕黄色颗粒状染色，广泛存在于胎盘组织各类细胞胞浆中。HBsAg阳性率呈现出由蜕膜细胞、滋养细胞、绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞至羊膜上皮细胞依次递减的趋势。在部分绒毛间隙可见HBsAg阳性染色，HBsAg受染细胞多呈片状或团块状分布。(2)胎盘组织中HBcAg阳性染色呈均匀颗粒状，分布于受染细胞的细胞核中，受染细胞多呈小灶状或散在分布，HBcAg阳性率呈现出由蜕膜细胞、滋养细胞、绒毛间质细胞至绒毛毛细血管内皮细胞依次递减的趋势。(3)对照组胎盘组织中未发现HBsAg及HBcAg阳性染色细胞，阳性率为零。(4)研究组孕妇中有4例HBsAg及HBcAg在胎盘组织中的分布，呈现出由绒毛毛细血管内皮细胞、滋养细胞至蜕膜细胞依次递减的趋势，阳性细胞着色强度逐渐减弱。讨论学者们普遍认为，HBV宫内感染的机制为经胎盘感染。1987年，Lin等^[1]用免疫组化PAP法检测了32例HBsAg和HBeAg双阳性孕妇足月分娩的胎盘，结果未检出HBsAg；Lucifora等^[2，3]分别用免疫组化法检测了12例HBsAg无症状携带者足月分娩的胎盘组织，发现HBsAg和HBcAg存在于绒毛血管内皮细胞中。国内阎水平等^[4]用免疫组化ABC法检测了HBsAg阳性孕妇足月分娩胎盘组织，发现HBsAg和HBcAg存在于胎盘组织各类细胞中，且检出率及阳性细胞数目从蜕膜细胞、滋养层细胞、绒毛间质细胞至绒毛毛细血管内皮细胞呈依次递减的趋势。王复生等^[5]用原位分子杂交技术测定了24例HBsAg和HBeAg双阳性孕妇足月分娩的胎盘组织，结果显示，HBVDNA主要分布于胎盘蜕膜细胞，而绒毛各层细胞未受侵犯。以上报道的研究结果差异显著。为此，我们用PCR法和免疫组化ABC法检测59例HBsAg阳性足月产妇的胎盘组织，结果显示，HBsAg和HBcAg阳性率分别是81.4％(48／59)、61.0％(36／59)。HBsAg和HBcAg检出率、阳性细胞所占比例及细胞着色强度由蜕膜细胞、滋养层细胞、绒毛间质细胞至绒毛毛细血管内皮细胞依次递减。绒毛毛细血管内皮细胞感染31例，其中24例发生了宫内感染，感染率为77.4％。HBV可感染胎盘组织中的各类细胞并传染给胎儿，与阎永平等报道的结果相似。HBV经胎盘宫内感染的机制，可能是孕妇绒毛间隙血中的HBV感染蜕膜细胞，再逐层感染胎盘细胞，直至绒毛毛细血管内皮细胞，或HBV直接感染绒毛滋养细胞至绒毛毛细血管内皮细胞，从而引起胎儿感染。本研究还发现，4例孕妇胎盘组织中，HBsAg和HBcAg阳性细胞的数目由绒毛毛细血管内皮细胞至蜕膜细胞逐渐减少，阳性细胞着色强度逐渐减弱，其中2例脐血HBV DNA阳性。提示HBV首先感染胎儿后依次感染胎盘各层细胞。此4例胎儿羊膜上皮细胞检出HBsAg和HBcAg，羊水、阴道分泌物HBVDNA均阳性，说明可能存在经阴道的上行感染，即阴道分泌物中的HBV依次感染胎膜、羊水、胎儿，然后感染胎盘组织的各层细胞。 20世纪80年代起，国内外学者先后证实，男性HBV感染者各级生精细胞和精子中存在游离型和整合型HBVDNA，有学者研究配偶无HBV感染的男性HBV携带者和其胎儿，测序结果显示，父儿HBVDNA同源性为98％-100％，精子中存在HBVDNA^[6]，进一步证实HBV经精子传播给胎儿的可能性。有学者用免疫组化法在HBsAg阳性妇女卵泡液中检出HBsAg^[7]；另有学者采用原位杂交技术在1例因重症肝炎死亡患者的卵巢中检出HBV DNA，主要存在于卵细胞胞浆和部分间质细胞^[8]。说明HBV可感染人卵细胞。既然人卵细胞可被HBV感染，就存在HBV经卵细胞传播给后代的可能。本研究中的2例胎儿感染是否经卵细胞传播，尚没有证实，但不能完全排除这种传播途径。本研究结果提示，HBV宫内感染的可能机制为：孕妇血中的HBV感染胎盘而导致胎儿感染；同时可能存在经阴道的上行感染，但也不能排除经卵细胞的传播途径，但仍以经胎盘感染为主。hc360慧聪网医疗器械行业频道慧聪医疗器械医疗器械医疗设备手术器械保健器材卫生材料
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