[摘要] 目的 了解真性红细胞增多症(PV)患者骨髓CD34阳性细胞的凋亡、增殖情况。方法应用双色流式细胞仪检测20例PV患者及10例原发性血小板增多症(ET)患者和12名正常人骨髓CD34阳性细胞Annexin Ⅴ以及细胞增殖相关抗原Ki67的表达情况并分析其与PV临床表现的相关性。结果 PVCD34阳性细胞AnnexinⅤ表达率为(15.％±1.45)％，ET为(15.53±1.76)％，明显低于正常对照组的(23.61±3.89)％(P<0.05)；CD34阳性细胞Ki67表达率PV为(48.79±11.68)％，ET为(49.60±9.98)％，明显高于正常对照组的(33.87±6.82)％(P<0.01)；凋亡增殖比PV为0.33±0.10，ET为0.32±0.02，明显低于正常对照组的0.72±0.11(P<0.01)；CD34阳性细胞凋亡与血红蛋白、白细胞计数、内源性红系集落呈负相关(分别r=-0.481，P=0.037；r=-0.538，P=0.026；r=-0.632，P=0.50)。凋亡增殖比与血红蛋白、白细胞计数呈负相关(分别r=-0.537，P=0.018；r=-0.667，p=0.003)。结论 PV患者骨髓CDN阳性细胞有低凋亡及高增殖特点，低凋亡与疾病严重度相关。
[关键词] 红细胞增多症，真性；造血干细胞，骨髓；细胞死亡；增殖
真性红细胞增多症(PV)为造血系统恶性增殖性疾病。其临床特点为以红细胞增多为主的两系或三系血细胞增多及由此产生的高黏血症，远期可并发骨髓纤维化，极少数转化为白血病[1]。红细胞生成素(Epo)通过减少骨髓红系祖细胞凋亡，促进红系祖细胞增殖，对于正常红系集落形成单位(CFU-E)的形成至关重要[2,3]。PV患者红系祖细胞在不加外源性Epo的情况下可以产生内源性红系集落(EEC)[4]，这提示PV患者的造血干／祖细胞可能存在增殖及(或)凋亡异常[5]。我们应用双色流式细胞仪检测PV患者骨髓CD34阳性细胞凋亡及增殖相关抗原Ki67的表达，以评价PV造血干／祖细胞增殖、凋亡特征并分析其与临床表现的相关性。
病例和方法
1 检测对象 2002年1月至2003年2月在中国医学科学院血液病医院门诊及住院诊治的PV患者20例，原发性血小板增多症(ET)10例，正常献骨髓者12名。全部患者的诊断及疗效判定依据国内统一标准[6]。20例PV患者中13例为初诊患者，3例为单纯放血治疗患者，4例应用羟基脲／干扰素治疗，平均时间为7个月，停药2周以上且血常规结果仍高于正常者。ET患者7例为初诊患者，3例为应用羟基脲治疗平均13个月的患者，血小板计数均高于正常值。
2 试剂 淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液学研究所生产，溶血素购自美国BD公司，皂素购自Sigma公司，FITC／PE标记的CD34、CD95、IgG1以及AnnexinⅤ-FITC试剂盒和PE标记Ki67抗体试剂盒均购自美国PharMingen公司(BD公司)。流式细胞仪(FACS)为美国BD公司生产。
3 方法
3.1 细胞凋亡的检测：取新鲜骨髓5ml，肝素抗凝，应用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞(BMMNC)，将待测细胞用PBS液洗涤2遍。
BMMNC凋亡情况的检测：将1×106 BMMNC加入PI及FITC标记的AnnexinV各5μl，室温(25℃)避光孵育15min。再加入400μl×Annexin Ⅴ结合缓冲液，终止反应。1h内应用流式细胞仪检测。阴性对照为1×106BMMNC不加PI及AnnexinⅤ。
CD34阳性细胞凋亡情况的检测：将1×106BMMNC加入PE标记的CD34单抗，避光4℃孵育45min。用PBS洗涤2遍后悬浮在100μL×Annexin Ⅴ结合缓冲液中。加入FITC标记的AnnexinⅤ5μl，室温(25℃)避光孵育15min。再加入400μl×Annexin Ⅴ结合缓冲液，终止反应。1h内应用流式细胞仪检测。阴性对照为仅加CD34单抗及两者均不加的1×106BMMNC。
3.2 骨髓CD34阳性细胞Ki67的分析：取新鲜骨髓200μl，肝素抗凝，将人AB血清加入新鲜骨髓，孵育5min，封闭非特异抗体。加入FITC标记的CD34单抗，避光4℃孵育45min。加入溶血素溶血，应用多聚甲醛固定15min，加入0.1％皂素室温(25℃)下破膜1h。弃去固定液及皂素，应用PBS洗涤2遍，加入PK标记的Ki67单抗，避光4℃孵育45min。应用PBS洗涤2遍，加多聚甲醛固定，24h内应用流式细胞仪检测。
3.3 流式细胞仪分析：应用流式细胞仪对BMMNC Annexin Ⅴ阳性、PI阴性细胞比例，AnnexinⅤ、Ki67在CD34阳性细胞中的表达进行检测。每个待测样本细胞数均>1×106，射门检测的细胞≥104。设定CD34、PI为前相角，Annexin Ⅴ、Ki67为侧相角。BMMNC凋亡检测的阴性对照为1×106 BMMNC不加PI及Annexin Ⅴ。应用1×106BMMNC仅加PI或仅加Annexin Ⅴ的结果调节补偿。CD34阳性细胞的凋亡检测的阴性对照为1×106**BMMNC加入CD34同型IgG1同时孵育。应用1×106BMMNC仅加Annexin Ⅴ、仅加CD34的结果调节补偿。Ki67阴性对照为试剂盒中专用的同型阴性对照试剂。平均荧光强度(MFI)值应为阳性荧光强度减去阴性对照荧光值。
4 统计学方法 率的比较采用Pearson卡方检验或Fisher's精确概率法分析；均数比较采用t检验；相关分析采用双变量Pearson相关分析及Kendall等级相关分析。皆用SPSS软件处理。设定BMMNC Annexin Ⅴ阳性、PI阴性细胞表达率与Ki67的表达率的比值为BMMNC凋亡／增殖比率(A／P)；CD34阳性细胞Annexin Ⅴ的表达率与CD34阳性细胞Ki67的表达率比为CD34阳性细胞的A／P。
结果
1 骨髓细胞凋亡水平 BMMNCAnnexin Ⅴ阳性、PI阴性细胞表达率PV为(5.99±2.00)％，ET为(7.18±2.96)％，低于正常对照组的(14.37±4.43)％(P<0.01)。CD34阳性细胞Annexin Ⅴ表达率PV为(15.96±1.45)％，ET为(15.53±1.76)％，明显低于正常对照组的(23.61±3.89)％(P<0.05)。
2 骨髓细胞增殖水平 BMMNC的Ki67表达率PV为(20.74±8.29)％，ET为(21.27±3.77)％，均与正常对照组的(21.07±9.76)％无明显差异。CD34阳性细胞Ki67表达率在PV为(48.79±11.68)％，ET为(49.60±9.98)％，两者明显高于正常对照组的(33.87±6.82)％(P<0.01)。
3 骨髓细胞A／P值 正常对照组BMMNC A／P为0.78±0.39，PV组为0.34±0.19，ET为0.35±0.15，两组增殖明显超过凋亡，与正常对照比较，差异有显著性(P<0.01)。CD34阳性细胞A／P在PV为0.33±0.10，ET为0.32±0.02，两者明显低于正常对照组的0.72±0.11(P<0.01)。
4 骨髓细胞凋亡与增殖情况与临床相关性 分析PV患者的临床资料，BMMNC凋亡与血红蛋白、白细胞计数、EEC呈负相关(分别r=-0.773，P<0.01；r=-0.568，P=0.017；r=-0.692，P=0.027)。骨髓CD34阳性细胞凋亡与血红蛋白、白细胞计数呈负相关(分别r=-0.481，P=0.037；r=-0.538，P=0.026)。BMMNC A／P与血红蛋白、白细胞计数呈负相关(分别r=-0.783，P<0.01；r=-0.632，P=0.006)。CD34阳性细胞A／P与血红蛋白、白细胞计数呈负相关(分别r=-0.537，P=0.018；r=-0.667，P=0.003)。
Annexin Ⅴ对迁移于早期凋亡细胞膜外侧的磷脂酰氨酸(PS)有高度亲和力、PI可与死亡细胞结合，可区别凋亡与死亡细胞。Annexin Ⅴ加PI是目前用于检测细胞凋亡的较敏感及特异指标[7]。Ki67是细胞增殖期DNA复制时所需的相对分子质量为345×103的蛋白质，近期的研究推测它可能是核基质成分。Ki67蛋白在G1晚期开始出现并在S、G2和M期持续存在，但在C0期细胞和C1早期不表达，它的比例代表分裂相细胞的比例，即细胞增殖率[8]。
我们应用双色流式细胞仪检测PV患者CD34阳性细胞凋亡情况以及细胞增殖相关抗原Ki67的表达情况，能够在BMMNC及造血干／祖细胞两个水平上评价PV是否存在高增殖、低凋亡特征，并分析其与临床表现的相关性，以加深对PV发病机制的认识。
我们的结果表明，BMMNC Annexin Ⅴ阳性、PI阴性细胞表达率在PV及ET患者明显低于正常对照组；PV及ET患者BMMNC Ki67表达率与正常对照组无明显差异；正常对照组BMMNC增殖与凋亡相近或略超过凋亡。PV组及ET组增殖明显超过凋亡。这一结果表明BMMNC凋亡减低是PV患者主要特点。
CD34阳性细胞Annexin Ⅴ表达率在PV及ET患者明显低于正常对照组。与正常对照相比较，Ki67表达率在PV及ET患者明显增高。PV与ET患者A／P明显低于正常对照组。PV患者CD34阳性细胞高增殖与低凋亡共存。
BMMNC凋亡与血红蛋白、白细胞计数、EEC呈负相关；A／P与血红蛋白、白细胞计数呈负相关。CD34阳性细胞凋亡、A／P均与血红蛋白、白细胞计数呈负相关。
以上说明造血干／祖细胞不仅增殖亢进，且凋亡减低。这反映了PV恶性造血克隆的功能性异常。临床上诊断PV、判断疗效应参考这类反映疾病本质的指标。hc360慧聪网医疗器械行业频道 慧聪医疗器械 医疗器械 医疗设备 手术器械 保健器材 卫生材料
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