[摘要]  目的  研究骨髓种植的人工血管在静脉系统的应用，旨在探索一种新的、更理想的静脉代用品。方法  选北京地区杂种犬8条，实验组和对照组各4条。实验组采用自体骨髓种植的涤纶双绒人工血管置换肾下下腔静脉，对照组则采用单纯自体血浆预凝人工血管，术后10d获取人工血管标本，观察其通畅率，行光镜、电镜检查，比较新生内膜厚度、新生内膜表面内皮化情况，并通过检测6-keto-PGElα和TXB2水平，比较分析实验组和对照组抗血栓能力。结果  实验组全部移植血管均通畅，对照组2／4条通畅，光镜下实验组的内膜厚度明显薄于对照组(P<0.01)，电镜发现实验组人工血管达到完全内皮化，而对照组表面则无成片内皮细胞存在。实验组6-keto-PGFlα水平明显高于对照组(P<0.01)，而TXB2水平实验组低于对照组(P<0.05)。结论  骨髓种植的人工血管在静脉系统10d时能实现人工血管腔面的快速完全内皮化，新生内皮细胞具有抑制新生内膜增生和抗血栓形成的能力。
    [关键词]  人工血；管静脉；  骨髓种植
    骨髓中含多种原始千细胞，在不同的环境有分化成多种细胞的潜力，已有研究证实骨髓中的一些原始干细胞可以分化成内皮细胞，且种植的人工血管用于动脉系统时可获得快速内皮化^[1]。我们设想如用骨髓种植人工血管，骨髓中的原始干细胞同样可以分化成内皮细胞从而达到人工血管腔面内皮化。
    材料与方法
    一、主要材料
    实验犬：北京地区杂种犬。针织涤纶双绒人工血管：Meadox Medicals Inc，美国。无创血管缝线：Prolene缝线，美国强生公司。自配3％戊二醛。Hanks液：Sigma Chemical CO。花生四烯酸：SigmaChemical CO。四氧化锇：Polysciences，Inc。塑料石蜡包埋剂：Monoject Scientmc St Louis美国。Queue细胞培养箱(美国)。Nikon-108型相差显微镜(美国)。JKOL JSM-T-300型扫描电子显微镜(日本)。JKOL JSM-1200EX型透射电子显微镜(日本)。LKB-5型超薄切片机(瑞典)。
    二、实验方法
1．实验动物分组：北京地区杂种犬8条，体重15-20kg，雌雄不限，随机分成2组，实验组和对照组各4条。
    2．预凝液的制备：麻醉后取犬静脉血和3.8％枸橼酸钠以9：l比例混匀，经500转／min的速度离心10 min后，取上层血浆，即为富含血小板血浆(PRP)^[2]。抽取犬髂骨红骨髓lml，和l ml自体血浆混匀，制成骨髓预凝液。
    3．人工血管的预凝：取直径8mm，长度为5 cm的针织双绒涤纶人工血管备用。实验组人工血管腔面分2次用1 ml骨髓预凝液加0.05ml 2.5％氯化钙的混合液预凝^[3]，并不断转动和牵伸血管，使之均匀地覆盖于人工血管腔面。对照组方法同前，但将骨髓预凝液改为自体血浆。
    4．手术方法：静脉注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉。行腹部正中切口，显露肾下段下腔静脉直至分叉部位。全身肝素化后(1 mg/kg)，切除5cm长下腔静脉，置换为等长预凝好的人工血管，近远端吻合口均以5-0Prolene缝线对端吻合。在右侧股部作-lcm长的侧侧股动静脉瘘，瘘处留置缝线，术后7d结扎关闭动静脉瘘。关闭切口前在各吻合口周洒少量氨苄青霉素粉。
    5．术后观察及处理：术后注意有无下肢肿胀，行走困难，股部动静脉瘘震颤情况及有无腹壁静脉曲张。术后第2天起口服阿斯匹林300 mg，潘生丁50mg，l次/d，服药1周。
    6．标本的制作：术后10d取标本，取出后立即用肝素盐水冲洗。
    7．纵向剪开、照相：取人工血管中段l cm标本，分别作光镜、扫描电镜和透射电镜检查。光镜标本以甲醛固定，制成石蜡切片，HE染色，光镜下观察内膜形态并测新生内膜厚度。透射电镜标本经戊二醛固定后，再用1％的锇酸固定，用乙醇逐级脱水，环氧树脂(Epon 812)包埋，制成超薄切片，以醋酸双氧铀-枸橼酸铅双染色；扫描电镜检查标本经戊二醛固定后，再用1％的锇酸固定，用丙铜逐级脱水，液体二氧化碳临界点干燥，表面喷金。
    8．放射免疫学测定：取面积1 cm×lcm以上的中段人工血管标本和自体下腔静脉标本放人2个自制的测量盒中。测量盒由基板和一个空心(底面积为1cm ×1cm)金属柱组成，两者可用螺丝固定在一起，在螺丝放松时将标本置人金属柱和基板之间，展平标本，拧紧螺丝，使连接处不漏水，这样形成一个底为lcm×lcm标本的瓶子，用Hanks液冲洗3次后加入l ml包含20mmol花生四烯酸的基质液，放人细胞培养箱37℃孵育20min，反复去除气泡后移人小瓶液氮下保存，用氚放射免疫技术测量PGl2和TXA2的代谢产物，6-Keto-PGFlα和TXB2^[4]。
    三、统计学方法
    人工血管内膜厚度、6-Keto-PGFlα和TXB2测量值用t检验。
    结果
    一、移植血管的大体标本所见
    术后10d取出人工血管，见实验组全部移植人工血管均通畅，对照组2／4条通畅，另外2条对照组人工血管内充满血栓。实验组血管腔面可见一层完整、光滑、白色、半透明的新生内膜，表面无明显凝血块。对照组2条通畅的血管腔面颜色偏暗，表面尚光滑，另2条内充满晦暗的血栓。
    二、光镜下所见
    光镜下实验组的内膜厚度明显较对照组薄，高倍镜下两组新生内膜表现。两组新生内膜厚度平均值分别为237.3 μm和790.4μm，差异有显著意义(P<0.01)。
    三、电镜所见
    1．扫描电镜检查发现：实验组人工血管在10d时即达到完全的内皮化，对照组人工血管内膜表面无内皮细胞覆盖，仅见纤维组织排列。
    2．透射电镜检查发现：实验组内膜表面可见一层细胞，排列紧密，形态上具有内皮细胞的特点：胞体扁长，细胞核大，核部胞体突出于腔面，胞浆可见微饮泡，表面有微绒毛。对照组表面无内皮细胞，仅见杂乱的纤维。
    四、射免疫检查结果
    实验组和对照组移植人工血管花生四烯酸主要代谢产物6-keto-PGFlα和血栓素A2的主要代谢产物TXB2体外测定值。
    讨论
    1978年Herring等^[5]首创以机械法搔刮自体静脉获取内皮细胞种植人工血管的方法，为寻找更好的血管代用品指明了一个新的方向，但因可用的静脉较少，以致内皮细胞的数量、质量均明显不够。以后Graham等^[6]采用胶原酶消化法提取内皮细胞并行体外培养增殖后种植人工血管法。Zilla等^[7]用培养的内皮细胞在体外种植人工血管，使之形成内皮化后再移植人体获得了很好的远期通畅率。体外培养虽能扩增细胞，但无法行临床同步的一期内皮细胞种植，且培养过程复杂，易受污染，也可能在细胞培养过程中内皮细胞发生变异。有人从肾周或大网膜等脂肪组织，甚至皮下脂肪获取微血管内皮细胞行人工血管种植也获得了人工血管内皮化，且证明有一定的抗血栓和抑制新生内膜增生的作用。此法获取的内皮细胞数量大大增加，但临床附加手术较大，患者不易接受，且内皮细胞需提纯，方法也较复杂，临床应用困难。还有人用取自腹膜和心包的间皮细胞种植人工血管，实验表明也可在人工血管新生内膜表面形成一层能分泌前列环素，具有纤溶功能的细胞。但间皮细胞并非内皮细胞，其具体功能及机制有待进一步研究。以上方法各有缺点，限制了临床应用，近年发展缓慢。    Asahara等^[8]在外周血中筛选CD34抗原阳性细胞时分离出一些内皮细胞的原始细胞，发现可分化成梭形的内皮细胞，培养3周显示它们有较强的增殖能力。Shi等^[1]成功地培养了CD34阳性细胞，在离体情况下也能分化成内皮细胞，并在动物实验时发现循环血液中的某些细胞对人工血管表面内皮化有一定作用，他们认为这可能是从心血管树上脱落的细胞流经人工血管时粘附于其上所致，称之为流落修复(fallouthealing)。后有学者证明循环血液中确实存在成熟的内皮细胞^[9]。而另一方面，Shi等^[10]在放射处理后的犬行白细胞抗原不匹配的骨髓移植时，在移植物表面收获了一批内皮细胞，PCR分析显示其基因型和供体相同，表明它们来自骨髓中的某些原始细胞，从而显示"流落修复"的细胞是由骨髓中的一些原始细胞分化而来。基于这一理论基础，Fujita等^[11]直接用骨髓种植人工血管置换犬胸主动脉，术后l周即获得广泛快速的内皮化。随后Bhattacharya等^[12]直接在骨髓中选择性提取CD34阳性细胞种植涤纶人工血管，置换犬胸主动脉，获得人工血管腔面快速的内皮化，且发现血管壁上的微血管形成增加。自体静脉虽是最理想的静脉代用品，但口径、长度限制较多，人工血管用于静脉转流的近、远期通畅率明显低于自体血管，故静脉更迫切需要一种具有抗血栓能力的代用品。骨髓直接种植人工血管方法简单，临床易于开展，可一期进行。我们的实验结果显示术后10d骨髓种植的涤纶人工血管在静脉系统可达到完全内皮化，电镜下大部分区域内皮细胞呈梭形，排列紧密，部分区域可见正向梭形演变的内皮细胞，形态具有典型的内皮细胞特点，而对照组无l例有新生内膜内皮化的迹象，充分说明能在如此短的时间内达到人工血管完全内皮化是和骨髓种植有直接关系。体外测量6-keto-PGFlα和TXB2的水平[分别为PGl2和血栓素A2(TXA2)的代谢产物]，发现实验组6-keto-PGFlα明显高于对照组，而TXB2实验组显著低于对照组，从功能上反应出骨髓种植组和对照组的差别，也进一步证实骨髓种植组新生内膜表面的新生内皮细胞具分泌抗血栓物质的功能。取材时实验组4条人工血管均通畅，而对照组仅2条通畅，尽管实验动物较少，但也能说明其具有提高通畅率的作用。实验组新生内膜厚度明显薄于对照组，证明此类新生的内皮细胞不仅具有抗血栓功能，也有抑制新生内膜增生的作用，这也就能改善人工血管远期通畅率。虽实验动物数目较少，也未进行远期效果的观察，但本实验初步显示了骨髓种植人工血管在静脉系统应用的优越性。Fujita^[11]在动脉系统的实验研究发现术后4周时骨髓种植人工血管出现了微小的钙化，这可能是与骨髓中有很多其他成分的细胞如成骨细胞等所致的副作用，提示用提纯的能分化为内皮细胞的原始干细胞(如CD34阳性细胞)行人工血管种植将更具前途。hc360慧聪网医疗器械行业频道  慧聪医疗器械  医疗器械  医疗设备 CT B超