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腺相关病毒介导胶质细胞源性神经营养因子转染牛眼虹膜色素上皮细胞

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-09-01 23:04:15

[摘要] 目的探讨以腺相关病毒(AAV)为载体对体外培养牛眼虹膜色素上皮细胞(IPECs)进行胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)转染，获得高效表达CDNP转基因细胞的可行性。方法采用狭隙杂交测定AAV-CDNF的滴度，按感染复数(M0I)为50对传二代IPECs进行AAV-CDNF转染，于含3％胎牛血清DMEM培养基中连续不换液培养4周，酶联免疫吸附测定(ELISA)细胞培养上清液中GDNF的量。同样方法对传二代IPECs进行AAV介导的绿色荧光蛋白(CFP)基因转染，于含20％胎牛血清DMEM培养基中进行常规细胞培养。荧光显微镜下每2d计数1次培养IPECs的GFP表达阳性率。结果 (1)AAV-CFP转染后，IPECs生长正常，于转染后4d部分IPECs开始出现GFP表达。GFP的表达在荧光显微镜490nm波长激发光下呈黄绿色，弥漫于整个胞质。转染8-10d后，IPECs中GFP的表达至高峰。(2)根据ELISA检测结果、经过计算，AAV-GDNF转染IPECs的培养上清液中GDNF的含量为(17.14±1.10)μg/L。结论 AAV-CDNF能有效地转染体外培养的IPECs和表达GDNF。 [关键词] 色素上皮，眼；上皮细胞；依赖病毒；神经生长因子类；转染；酶联免疫吸附测定虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelial cells，IPECs)与视网膜色素上皮细胞(retinal pigmentepithelial cell,RPECs)具有相同的胚胎发育来源，体外培养中具有相似的生物学功能，有望替代RPECs用于自体移植^[1]。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)可延长体外培养视网膜杆体细胞的存活时间，视网膜下腔注射GDNF可对视网膜变性(rd／rd) 鼠的视网膜色素变性产生有效的挽救作用^[2,3]。如果将GDNF基因导入体外培养IPECs产生高表达，并通过细胞移植将这两种技术结合起来，则有可能获得更有效的挽救效果。为此，我们观察了腺相关病毒(adeno-associated，AAV)载体携带人GDNF对体外培养牛IPECs的转染及转染后GDNF的表达情况。材料和方法一、实验材料 IPECs来自本实验建立的新生牛眼IPECs培养体系^[4]。AAV-GDNF粗制液、AAV-GFP粗制液、地高辛标记GDNFDNA探针、pGEMT-GDNF质粒(由中国协和医科大学基础所焦建伟博士惠赠)，地高辛标记DNA探针和检测试剂盒、尼龙膜(德国Boehringer Mannhein公司产品)，GDNF酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(美国Promega公司产品)。二、AAV-GDNF滴度测定常规紫外分光光度法测定pGEMT-GDNF质粒DNA浓度^[5]。分别取AAV-GDNF粗制液和pGEMT-GDNF质粒溶液各50μl，6×SSC缓冲盐液进行1:10-l:10⁶的10倍倍比稀释，100℃下变性10min后用抽滤加样器将样品DNA抽滤到尼龙膜上，紫外线灯下交联30 s。按试剂盒说明书依次进行预杂交、杂交，洗膜、封闭和显色。扫描仪扫描记录杂交结果。三、AAV-GDNF对体外培养IPECs的转染取1瓶生长至90％融合的传一代IPECs，按常规细胞传代培养将细胞分种至3个25 cm²培养瓶，细胞接种浓度为7.75×10⁴个／ml，每瓶接种1.5 ml。加含20％胎牛血清的DMEM培养基进行常规细胞贴壁培养。3d后对其中2瓶细胞进行AAV-GDNF转染(另1瓶作为对照仍进行常规细胞培养)：弃去培养液，按感染复数(M0I)为50的剂量加入适当稀释的AAV-GDNF使其完全覆盖细胞培养面积，37℃孵育2h，每隔15 min振摇1次，使AAV-GDNF与IPECs充分接触。加入适量DMEM培养基和胎牛血清(胎牛血清的终浓度为3％)，继续按常规进行细胞贴壁培养。相差倒置显微镜(日本Nikon公司产品)下对细胞生长情况进行观察，每周观察2次。4周后对2瓶转基因IPEC的培养液(即样品l，样品2)中GDNF含量进行ELISA检测。检测前不更换细胞培养液。严格按试剂盒说明对试剂盒所提供GDNF标准品(即标准品1，标准品2)进行GDNF标准曲线测定和待检样品GDNF含量测定，以l×SSC为空白组，以未进行AAV-GDNF转染的IPECs培养液为检测样品的对照组，并设复孔。四、AAV-GFP对体外培养IPECs的转染及检测取l瓶90％融合的传一代IPECs，按常规细胞传代培养将细胞分种至6个培养皿(直径35 mm)，细胞接种浓度为7.75×10⁴个／ml，每个培养皿接种0.5 ml细胞悬液。常规IPECs贴壁培养3 d后按MOI为50进行AAV-GFP转染。继而保留转染液，分别加入适量DMEM培养基和胎牛血清(胎牛血清的终浓度为20％)，常规贴壁细胞进行培养，每4 d换液1次。转染后每2d取出1个皿，终止培养，于荧光显微镜(日本Olympus公司产品)490 nm波长激发滤光片下观察IPECs的GFP表达情况。连续计数200个IPE中的GFP表达阳性的细胞数，并照相记录。结果一、AAV-GDNF病毒滴度的检测经过计算，pGEMT-GDNF质粒DNA的浓度为40mg/L。因此稀释后的点样浓度依次为4-4×10^-5mg/L。根据pGEMT-GDNF的相对分子质量(约1.136×10⁶)可计算出各点样孔质粒DNA分子的分子密度依次为2×10¹²-×10⁷个／ml。杂交结果显示，AAV-GDNF病毒DNA 1:10²稀释度的杂交信号与质粒DNA的l:10⁴稀释度(分子密度相当于2×10⁹个／ml)的杂交信号近似。因此经过换算，AAV-GDNF病毒颗粒密度约为l×10¹¹个／ml。二、AAV-GFP转染后GFP在IPECs的表达 AAV-GFP转染后，IPECs的生长正常。转染后4d，少量IPECs开始出现GFP表达：GFP的表达在荧光显微镜490nm波长激发光下呈黄绿色，弥漫于整个胞质。AAV-GFP转染2、4、6、8、10、12 d后IPECs中GFP的表达阳性率分别为0％、8％、27％、58％、62％、64％，提示转染8-12d后GFP表达至高峰。三、GDNF在AAV-GDNF转染后IPECs培养上清中的表达量 IPECs(1.16×10⁵个／25 cm²培养面积)接受AAV-GDNF转染后，经低浓度血清培养体系(5 ml培养液／25 cm²培养面积，含3％胎牛血清)连续1个月的不换液培养，细胞仍保持良好的形态，生长约50％融合。根据GDNF标准品ELISA检测标准曲线线性回归方程，由表2可计算GDNF在AAV-GDNF转染后IPECs培养上清中的表达量。根据GDNF检测试剂盒说明书，GDNF浓度在15.63-1000 ng／L时A值与所对应的浓度呈直线线性相关，因此通过落在该区间的样品A值可计算出所检测样品的GDNF含量为(17.14±1.10)μG/L，而对照组(正常IPECs的培养上清液)中无GDNF表达。讨论一、关于AAV病毒载体 AAV病毒是一种复制缺陷型病毒，可以原病毒的形式整合在宿主细胞第19号染色体长臂，随宿主细胞染色体的复制而复制，但不产生任何致病作用。因此以重组AAV为载体可实现高效基因转染及转染后持续表达。由于AAV对细胞的感染是由靶细胞膜上存在的AAV受体介导的^[6]，AAV的转染效率与细胞种类有关，因此需要研究AAV对IPECs感染的生物学特性。本文的研究结果表明，AAV病毒载体可有效地感染体外培养的IPECs，其转染阳性率可达60％以上。AAV-GFP对IPECs的转染实验表明：细胞转染后，AAV所携带的目的基因经过约4 d的潜伏期后可以出现表达，8-10 d后目的基因的表达进入高峰，即AAV转染IPECs后目的基因的表达潜伏期大约是4-10d。二、关于AAV-GDNF转染及表达 GDNF是一种首先从胶质细胞系B49的分泌因子中克隆出的神经营养因子^[7]，在多种神经组织和非神经组织中有表达，对许多周围神经元及感受器有一定的营养作用^[8,9]。Carwile等^[2]在体外实验中发现，GDNF可延长视网膜杆体光感受器细胞的存活时间，对杆体细胞的外节有一定的维持作用。Frasson等^[3]尝试将GDNF用于rd／rd鼠视网膜变性的治疗，产生了有效的挽救作用，表明GDNF可能是治疗视网膜色素变性的1种有效药物。要实现AAV-GDNF转染IPECs移植治疗视网膜色素变性，必须先获得GDNF在转基因IPECs静止期的高效表达。本实验体系研究结果表明，AAV-GDNF转染IPECs可高效表达GDNF，而非转基因IPECs则不表达GDNF。由于AAV转染后外源基因的表达效率与细胞分裂速率有关，而RPE细胞在生理状态下并无增殖和分裂，移植于视网膜下腔的IPECs也如此。为此，本实验采用低血清环境连续30 d培养，不进行细胞换液和传代，使细胞处于相对低分裂、低增殖的状态，实验结果可在一定程度上反映出AAV转染后静止期的IPECs中GDNF的表达情况。综上所述，AAV-GDNF有效转染IPECs，并获得持续、高效的GDNF表达，为我们进行AAV-GDNF转染IPECs移植治疗视网膜色素变性提供了理论基础。
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