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儿茶酚-O-甲基转移酶基因多态性与妊娠高血压综合征关系的研究

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-09-01 23:04:15

[摘要] 目的探讨儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)基因第158／108位密码子，从缬氨酸到蛋氨酸的错义突变多态性与妊娠高血压综合征(妊高征)的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，检测102例妊高征患者(妊高征组)及94例正常晚期妊娠妇女(对照组)的COMT基因多态性位点频率(两组孕妇的年龄及孕周相匹配)。结果妊高征组COMT基因型频率：野生型(HH)、杂合子(HL)、突变纯合子(LL)分别为56.9％、38.2％、4.9％，对照组分别为47.9％，43.6％、8.5％。两组比较，差异无显著性(P>0.05)。妊高征组COMT等位基因频率H、L分别为76.0％、24.0％，对照组分别为69.7％、30.3％。两组比较，差异无显著性(P>0.05)。结论 COMT基因第158／108位密码子从缬氨酸到蛋氨酸的错义突变多态性与妊高征的发病及病情轻重程度无相关。突变基因型并没有增加妊高征的发病风险。 [关键词] 妊娠并发症，心血管；高血压；儿茶酚-O-甲基转移酶；基因；多态现象(遗传学) 妊娠高血压综合征(妊高征)是妊娠期特有的疾病，有较强的遗传倾向^[1，2]。研究表明，妊高征孕妇血浆儿茶酚胺，尤其是去甲肾上腺素水平明显高于正常孕妇，儿茶酚胺水平升高是妊高征患者小动脉痉挛的原因之一^[3-6]。而儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)是儿茶酚胺代谢过程的主要降解酶，通过催化儿茶酚胺在3位羟基上的甲基化而降解儿茶酚胺，其活性高低由遗传因素决定。因此，其编码基因的多态性可能与妊高征的遗传易感性有关。COMT基因第4外显子C1947-A的点突变导致酶的热不稳定性改变，酶活性降低3-4倍^[7]。目前的研究发现，COMT基因多态性与多种疾病有关，我们采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCRFRLP)技术，分析与探讨COMT基因多态性与妊高征遗传易感性的关系数。资料与方法一、研究对象 2000年12月至2002年11月，在吉林大学第二医院妇产科和大庆油田总医院妇产科住院的妊高征患者102例为妊高征组，平均年龄(26.2±3.1)岁，平均孕周(38.4±2.8)周；选择同期正常妊娠妇女94例为对照组，平均年龄(27.5±2.8)岁，平均孕周(39.4±1.2)周。两组比较，差异无显著性(P>0.05)。两组孕妇均为单胎、初产，均无高血压、心脏病、肾病、糖尿病及肝病病史，无输血及免疫治疗史。妊高征诊断依照乐杰主编的《妇产科学》(第5版)中的标准。二、方法 1．标本采集和处理：两组孕妇在征得同意后抽取其肘静脉血2ml，以3.8％枸橼酸钠盐抗凝，血样立即置-20℃保存备用。采用宁波星普基因技术有限公司提供的微量DNA提取试剂盒提取DNA。 2．COMT基因型的检测：(1)PCR：按文献^[8]设计引物：上游引物为F，其序列为5'-TCGTGGAC-GCCATGATFCAGG-3'，下游引物R，其序列为5'-AGGTCTGACAACGGGTCAGGC-3'。 PCR总反应体系25μl。反应条件为94℃预变性5min，95℃变性35s，63℃复性40s，72℃45s，30个循环后72℃延伸10min。其PCR产物为217bp的DNA片段，中间包括2个对应于NlaⅢ的酶切位点，其中一个呈多态性，由此形成限制性片段长度多态。(2)限制性酶切：PCR扩增产物NlaⅢ的酶切体系：总体积20μl，H₂05.1μl，10 ×缓冲液(buffer)2.0μl，乙酰基(BSA，10mg／ml)0.2μl，限制性内切酶NlaⅢ(10⁴U／ml)0.4μl即7U和PCR扩增产物12μl。37℃恒温箱中闭盖进行酶切4.5h。酶切产物经12％聚丙烯酰胺凝胶电泳及伊文思蓝染色，经凝胶成像系统成像后，根据酶切图判断基因型。经NlaⅢ酶切后COMT基因野生型(HH)为8lbp、136bp2个片段，COMT基因突变纯合子(LL)为40bp、81bp、96bp3个片段，COMT基因杂合子(HL)为40bp、81 bp、96bp、136bp 4个片段。其中，40bp片段因过小而泳出。三、统计学方法应用拟合优度x²检验判断基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，基因型频率及等位基因频率采用t检验，统计分析均在SPSS软件包中进行。结果一、两组孕妇COMT基因型频率和等位基因频率的比较妊高征组孕妇COMT基因型HH、HL、LL频率与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。妊高征组孕妇COMT等位基因频率H、L与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。两组的COMT基因型分布应用拟合优x²度检验，x²值分别为0.24和0.10，P值均>0.05，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。妊高征组与对照组COMT基因型频率相对风险分析，HL／LL：OR=0.49(95％CI：0.15-1.58)，LL／HH：OR=0.74(95％CI：0.41-1.33)。二、妊高征组轻、中、重度孕妇COMT基因型频率比较妊高征组轻、中、重度孕妇COMT各基因型频率与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。讨论一、COMT与妊高征的相关性妊高征是妊娠期所特有的疾病，迄今为止，仍为孕产妇和围生儿死亡的重要原因之一。其病因学说众多，至今尚无定论。研究表明，妊高征患者交感神经紧张性增加，血中儿茶酚胺尤其是去甲肾上腺素含量增高，可能与妊高征发病相关^[5-6]。COMT是儿茶酚胺代谢过程的主要降解酶，其活性改变导致血中儿茶酚胺水平的变化，可能在妊高征发病过程中起一定作用。Bates，Whitworth等^[9]测定了24例孕4周以上的妊高征患者的红细胞COMT活性，并以100例正常妊娠妇女作对照。结果显示，妊高征患者红细胞COMT活性显著高于正常妊娠者。并认为增高的COMT活性反映了一种保护机制，即迅速灭活循环中的儿茶酚胺，以减少肾上腺素、去甲肾上腺素对心血管系统的作用。而Bamea等^[10]提出了妊高征患者胎盘COMT活性降低的观点，认为低活性COMT损害胎盘代谢儿茶酚胺的能力，过量的儿茶酚胺可影响胎盘激素的代谢及胎盘血流。由于对C0MT与妊高征相关性的研究甚少，目前很难对C0MT做出某种令人信服的结论。二、COMT基因多态性与妊高征的关系 COMT是一种在人体内广泛存在的酶，在镁离子存在的条件下催化儿茶酚第3位羟基甲基化而降解儿茶酚胺，是具有生物活性或毒性的儿茶酚胺的主要代谢酶。在人类COMT编码基因位于22号染色体1区带2亚带(22q^11.2)^[11]，其第4外显子存在一个G1947-A的置换点突变，使其编码的158／108朋位氨基酸由缬氨酸(Val)变为蛋氨酸(Met)，引起该酶的热不稳定性改变，导致酶活性降低3-4倍研究发现，COMT的活性在个体间差异很大^[12]，在人群中可以分成高活性、中等活性、低活性3种表型，是由COMT-H(高活性)和COMT-L(低活性)两个等位基因决定，以共显性方式遗传，其基因型分别为COMT-HH、COMT-HL、COMT-LL。已有资料表明，COMT的这种基因多态性在不同种族阳个体间的差异与精神疾病、帕金森病及乳癌等的遗传易感性有关。由于妊高征有较强的遗传倾向，基因变异可能是妊高征发病的重要因素之一，本研究目的是探讨C0MT基因多态性与妊高征发病的关系。结果显示，COMT-L等位基因频率分布在妊高征组及对照组无统计学意义，其基因型频率分布亦无显著性差异。相对风险分析，COMT基因型LL、HL、HH发病风险无明显差异。这表明COMT基因第158／108位密码子从缬氨酸到蛋氨酸的的错义突变多态性与妊高征发病无相关性，COMT-L等位基因与妊高征无关联，突变基因并没有增加妊高征的发病风险。但是，妊高征的发生和发展是极其复杂的过程，它很可能是一种由多基因决定和受多种环境因素影响的疾病。单纯一个基因的缺陷并不能导致妊高征的发生。而且COMT的基因型分布频率和H、L等位基因分布频率在不同种族、群体、个体间也存在差异。虽然我们的研究提示COMT基因多态性改变与妊高征的发病无相关性，但并不能说明COMT基因多态性与妊高征的遗传易感性绝对无关，因为COMT基因有数个多态位点。本研究只是做了其中的一个，其他位点的多态性改变与妊高征发病的关系尚待研究，以进一步证实COMT基因与妊高征的关系。
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