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日本血吸虫DNA疫苗的构建及其保护性免疫

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-12-27 22:32:05

[摘要] 目的制备日本血吸虫裸露DNA疫苗(pBK-Sj14-3-3)，观察其在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用。方法以RT-PCR方法扩增Sj4-3-3基因，并将其亚克隆入真核表达载体pBK；提取、纯化重组质粒pBK-Sj4-3-3，肌肉注射法接种BALB／c小鼠；日本血吸虫尾蚴攻击感染后，剖杀小鼠，计算减虫率和减卵率，观察pBK-Sj4-3-3对小鼠肝脏虫卵肉芽肿形成的影响。结果 1％琼脂糖凝胶电泳显示，RT-PCR扩增产物与EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切重组质粒得到的插入片段大小相同，约为765bp，核苷酸序列测定证实插入片段为Sj4-3-3；免疫注射pBK-Sj4-3-3后，14-3-3组平均每只小鼠获检成虫数为22.9±9.6，与对照组成虫数(31.3±7.3)比较，14-3-3组小鼠平均成虫负荷下降了27％。经5％氢氧化钾消化后，14-3-3组平均每克肝组织虫卵数为16600±5904，每对成虫平均虫卵数为4769±1156，与对照组平均每克肝组织虫卵数(77875±4326)和每对成虫平均虫卵数(9723±2074)比较，减卵率为79％，每对成虫减卵率为51％。肝脏虫卵肉芽肿平均直径下降了29％。结论 DNA疫苗pBK-Sj4-3-3构建成功，且在小鼠抗血吸虫感染中有一定的免疫保护作用，是日本血吸虫病潜在的疫苗候选分子。 [关键词] 血吸虫，日本；疫苗，DNA；免疫法，被动血吸虫疫苗作为血吸虫病防治措施的一种重要补充，近年来已进行了很多研究，特别是第三代疫苗--核酸疫苗在抗寄生虫感染的研究中取得了很大的进展^[1]。近年来，信息接头蛋白14-3-3作为早老性痴呆(AD)和人类克-雅病(CJ)的诊断标志引起了人们的关注^[2，3]。 Schechtman等^[4]证明曼氏血吸虫14-3-3蛋白(Sml4-3-3)能诱导C57Bl／6J小鼠产生25％-46％的成虫减虫率，提示其可能成为抗血吸虫新的疫苗候选分子。我们在克隆和表达日本血吸虫信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3)编码基因的基础上^[5]，将其克隆人含巨细胞病毒启动子(CMV)的真核表达载体pBK，并将重组质粒pBK／Sj14-3-3以裸露DNA疫苗形式经肌肉注射免疫BALB／c小鼠，以探讨该抗原编码基因的核酸疫苗能否在血吸虫攻击感染时诱导机体的免疫保护作用，现将结果报道如下。材料和方法一、材料日本血吸虫尾蚴，含成熟尾蚴的阳性钉螺购自浙江省医学科学院寄生虫病研究所，以常规方法逸得尾蚴。实验动物：6-8周龄雌性BALB／c小鼠和2.5 kg家兔由安徽医科大学医学实验动物中心提供。菌株和质粒：大肠杆菌BL21株和真核表达载体pBK由本室留存。总RNA提取试剂盒为华美公司产品；第一链cDNA合成试剂盒为美国Gibco公司产品；Taq DNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒为美国Promega公司产品；限制性内切酶EcoRI、XhoI及PCR分子量标准、dNTP、琼脂糖均为河南华美公司产品；T4 DNA连接酶为瑞士Roche公司产品；DNA片段凝胶回收试剂盒为上海华舜公司产品；其余试剂为国产分析纯。二、方法 1．重组真核表达载体pBK-Sj14-3-3的构建：根据Sj14-3-3编码基因的核苷酸序列设计并合成一对引物：P1：5'TGG GAA TTC ATG AGG GAT TCGTFC-3'，P2：5'-TAG CTC GAG TCA GCC ATC ATTTCC G-3'，2条引物的5'端分别引入限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点。引物由上海基康公司合成。提取日本血吸虫成虫RNA，逆转录生成c DNA第一链，操作按试剂盒说明书进行。以日本血吸虫成虫cDNA为模板进行PCR，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。按PCR产物纯化试剂盒步骤纯化扩增产物，用限制性内切酶EcoRⅠ和Xho Ⅰ酶切PCR产物和质粒pBK；双酶切后的DNA片段经凝胶回收试剂盒回收纯化，按目的片段与载体摩尔比4:1，4℃连接过夜。按制备氯化钙的方法制备新鲜BL₂₁，感受态细胞；用连接混合物转化感受态细胞；克隆PCR方法快速鉴定阳性重组子；将阳性克隆扩大培养，碱裂解法小量提取质粒；双酶切和PCR进一步鉴定阳性克隆。阳性克隆进行核苷酸序列测定确证。用碱裂解法大量提取质粒pBK和pBK-Si14-3-3，754型紫外分光光度计分别测量两种质粒的A₂₆₀。和A₂₈₀，并计算出含量(S／L)和纯度(A₂₆₀／A₂₈₀)。 2．免疫保护作用的观察：(1)免疫方案：20只BALB／c小鼠分实验组和对照组，每组各10只。各组小鼠在免疫前24 h于后腿股四头肌注射50 μl0．5％的盐酸布比卡因。实验组每只鼠注射100μgpBK-Sj14-3-3，对照组每只鼠注射100μgpBK；3周后相同剂量加强免疫1次。(2)攻击感染：末次加强免疫5 d后，实验组及对照组每鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(40±1)条。(3)减虫率和减卵率：尾蚴攻击感染6周后，眼眶放血，解剖小鼠收集血吸虫成虫，留取小鼠肝脏备用。分别计数每只小鼠中收集的血吸虫成虫数，计算每组小鼠的平均成虫数和雌虫数，计算减虫率：减虫率=(对照组平均检获成虫数-实验组平均检获成虫数)／对照组平均检获成虫数×100％。称取鼠肝总重量，按常规方法用5％氢氧化钾消化肝组织，计算每克肝组织虫卵数(EPG)，按下述公式计算肝组织减卵率及每对(雌雄合抱)成虫减卵率(EPWP)：减卵率=(对照组平均EPG-实验组平均EPG)／对照组平均EPG×100％。 3．肝脏肉芽肿的变化：各鼠取大约0.5 cm×0.5 cm×0.5cm新鲜肝组织，生理盐水洗涤后置10％福尔马林PBS液中固定，制成石蜡组织块，以7μm厚度连续切片，HE染色后光镜下观察。使用目镜测微尺，选择单卵肉芽肿，测量最大直径，再按垂直方向测量另一最大直径，取其均值，每组以25个单卵肉芽肿大小的平均直径(μm)表示。结果 1．重组表达载体pBK-Sj14-3-3的构建：以日本血吸虫cDNA为模板，用所设计和合成的引物扩增出Sj14-3-3基因。1％琼脂糖凝胶电泳显示，在994bp和697bp之间有1条特异性条带，相对分子质量与理论值765 bP相符。重组质粒pBK-Sj14-3-3经过限制性内切酶EeoRⅠ、XhoⅠ双酶切和以重组质粒为模板的PCR后，1％琼脂糖凝胶电泳可见1条与PCR产物大小相同的条带，表明重组表达载体构建成功。 2．根据公式：质粒DNA=(A₂₆₀×稀释倍数)／20，测得质粒pBK和pBK-Sj14-3-3浓度分别为2.27g／L和2.15 g／L；纯度A₂₆₀／A₂₈₀分别为1.910和1.925，在1.8-2.0之间，说明纯度很好。 3．减虫率和减卵率：(1)减虫率：尾蚴感染6周后，剖杀两组小鼠，对照组平均每只小鼠获检雌虫数为14.1，雄虫数为17.2，总计成虫数为31.3±7.3。14-3-3组平均每只小鼠获检雌虫数为3.9，雄虫数为19.0，总计成虫数为22.9±9.6，与对照组比较，14-3-3组的减虫率为27％[(31.3-22.9)／31.3](P<0.05)，减雌率为72％[(14.1-3.9)/14.1×100％](P<0.01)。(2)减卵率：两组小鼠肝脏经5％氢氧化钾消化后，对照组平均每克肝组织虫卵数为77875±4326，每对成虫平均虫卵数为9723±2074。14-3-3组平均每克肝组织虫卵数为16600±5904，每对成虫平均虫卵数为4769±1156，与对照组比较，减卵率为79％[(77875-16600)／77875×100％]，每对成虫减卵率为51％[(9723-4769)／9723×100％]。 4．鼠肝脏肉芽肿的变化：(1)对照组与14-3-3组小鼠肝脏单卵肉芽肿平均直径分别为(182±18)μm和(256±30)μm，与对照组比较，14-3-3组虫卵肉芽肿平均直径下降了为29％(P<0.01)；(2)HE染色显示，对照组有大量肉芽肿形成，面积较大，伴有肝细胞坏死，而14-3-3组肉芽肿数量少，面积较小，肝细胞相对完整，多处可见炎症细胞浸润而无肉芽肿形成。讨论血吸虫14-3-3蛋白的研究始于1995年，初步动物实验结果证明，此重组抗原可能具有疫苗应用前景。我们通过肌肉直接注射免疫，观察了该疫苗在血吸虫感染过程中对小鼠的免疫保护作用。结果显示，与对照组相比，14-3-3组小鼠日本血吸虫成虫负荷下降了27％，平均每克肝组织虫卵负荷下降了79％，平均每对成虫产卵下降了51％，肝脏虫卵肉芽肿平均直径下降了29％。血吸虫疫苗的研究，既可通过抗感染免疫的途径，也可通过抗病免疫的途径。抗病免疫包含了抑制血吸虫雌虫产卵的抗生殖免疫和抑制虫卵发育成熟的抗卵胚免疫以及抑制虫卵产生和释放免疫病理性抗原等。尽管与WHO认可并已进入临床试验的谷胱甘肽转移酶(CST)40％左右的减虫率相比，14-3-3组总体减虫率并不理想，但在降低虫卵负荷方面作用较显著。14-3-3组小鼠雌虫检出率低，而对照组相对较高，减雌率为72％，这是14-3-3蛋白具有抑制雌虫生长发育，还是感染过程中单性感染的偶然现象，有待于进一步证实。另外，我们还发现对照组小鼠肝脏有大量肉芽肿形成，面积较大，且伴有肝细胞坏死，而14-3-3组肉芽肿数量少，面积较小，肝细胞相对完整，多处可见炎症细胞浸润而无肉芽肿形成，表明14-3-3可能具有较好的免疫作用。日本血吸虫产卵量高，致病作用强，虫卵沉积可引起血管堵塞、组织坏死、肉芽肿反应和组织纤维化。虫卵在日本血吸虫对人体的致病过程中起着重要作用。在感染不可能完全遏制时，尽量控制成虫产卵和减轻虫卵造成的病理损害，是防治血吸虫病的又一途径。本研究中核酸疫苗的保护作用不显著，有待于从改造插入基因序列和改变载体类型、免疫剂量、次数、免疫途径以及实验动物种类等方面，特别是插入基因序列方面进一步深入研究。hc360慧聪网医疗器械行业频道慧聪医疗器械医疗器械医疗设备手术器械保健器材卫生材料
信息来源：李德发陈月生祖莹等


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