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左旋咪唑预防生物心脏瓣膜钙化的实验研究

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-07-13 17:26:37

近年来研究发现，生物心脏瓣膜钙化与碱性磷酸酶(AKP)密切相关，戊二醛处理的牛心包的死亡细胞仍有AKP活性^[1,2]，移植后能促使宿主迅速吸收AKP并沉积于生物瓣中；钙化抑制剂中A1³⁺、Fe³⁺等能作用于AKP存在部位^[3]。左旋咪唑为AKP特异性抑制剂，在抑制生物瓣表面AKP活力的同时，也有可能抑制和(或)延缓生物瓣钙化过程。本研究初步观察AKP特异性抑制剂左旋咪唑对兔体内牛心包片钙化的抑制作用。材料与方法 1．实验动物与材料：3个月龄左右的健康新西兰幼兔45只，平均体重(1.71±0.35)kg，随机分为A、B、C 3个组，每组15只。在屠宰场现场取出1-2岁新鲜黄牛心前区牛心包组织，除去表面脂肪，按常用制备牛心包瓣方法，以0.65％戊二醛磷酸盐缓冲液(pH值7.4)制备牛心包片保存备用。将制备并保存2周后的牛心包组织，剪成1 cm2**的小方片，反复冲洗后备用。另取部分牛心包片冲洗后置新鲜配制的0.1 mol／L左旋咪唑灭菌液^[4]中浸泡24-48 h，备用。植入前取样做细菌培养，阴性者用于实验。左旋咪唑为广东省江门制药厂产品(批号980102)。钙测定试剂盒为上海科华-东菱诊断用品有限公司提供。 2．方法：采用2.5％戊巴比妥钠1 ml／kg行静脉注射麻醉，于兔背做4个1 cm长的切口，沿切口将两侧皮下组织分离至可容纳4片心包片的间隙。A、B组兔皮下间隙内植人用戊二醛处理的牛心包片，C组植入用左旋咪唑灭菌液浸泡过的牛心包片，牛心包片平展置人，每一切口植入4片，每只兔共置人16片。缝合切口。术后肌注青霉素3 d预防感染，饲料中加人钙片，每只0.25 s／d。B组加服左旋咪唑25mg／kg，2次／d，共8周。于术后第2、4、6、8周分别取每只家兔1个皮肤切口内的牛心包片测量其钙含量。 3．钙含量测定：取自然干燥至恒重牛心包1片分别在分析天平上称重，然后每片加人1.0ml消化液(HNO₃：HClO₄为3：1)至无色蒸干，再加入1.0 ml去离子水，于7170A自动生化分析仪(日本日立公司产品)中检测，方法为甲基麝香酚兰比色法，测定其吸光度(A)值，波长612nm。结果 (1)饲养期间兔生长良好，自然死亡5只(A组2只，B组3只)，标本废弃不用。到第8周时B、C组平均体重为(1.88±0.33)kg／只，A组为(1.90±0.31)kg／只(P>0.05)。(2)未植及植入后第2、4、6、8周牛心包片的钙含量。(3)3组牛心包片取出时均发现其周围形成不同厚度的纤维包裹，随植入时间而明显；部分牛心包有卷缩，有钙化者更明显；钙化灶呈淡黄色或黄白色片状斑，分布不均，随植入时间增大。A、C组钙化较B组重。经戊二醛保存但未植入的心包片胶原纤维完整，无变性及破坏；植入的心包片均有不同程度的钙化，A、C组较B组严重。钙盐主要沉积于胶原纤维中，胶原纤维肿胀、变性甚至断裂，胶原结构模糊不清。各组心包片内均有细胞浸润，以淋巴细胞为主，散在多核巨噬细胞。钙化点周围及其内部见明显多数坏死炎症细胞。弹性纤维和胶原纤维染色结果同前。A、C组较B组明显严重。经戊二醛处理2周以上心包片AKP染色阳性。A、B、C组植入24h后AKP染色阳性范围主要集中于瓣片边缘，无明显细胞浸润。随植入时间延长，植入瓣片全层均呈不同程度AKP染色阳性，钙盐沉积明显处AKP染色也强。同期B组AKP染色明显比A、C组浅淡。AKP阳性明显部位即为细胞浸润明显部位，且见炎性细胞AKP染色阳性。未植入的牛心包片结构紧密、清晰。植入钙化心包片出现细粒状高电子密度影，部份区域细粒状钙化灶聚集一起形成大的钙化灶。钙化灶多位于胶原纤维间隙，或附着于胶原纤维表面。由于钙化的累及，胶原纤维有不同程度肿胀、断裂。这种变化在A、C组较B组明显。讨论 (1)AKP与生物瓣钙化：1989年金磊等^[5]用Sodium-β-glycerophosphate为底物的钙钴法发现经戊二醛处理的牛心包瓣组织中AKP活性相当于新鲜组织的1／2以上，证实AKP活性被破坏的瓣片组织钙化明显减轻。本研究发现，仅经戊二醛处理2周以上未埋植的牛心包片中仍有AKP活性，在植入兔体内24 h后心包边缘与宿主机体接触部位AKP染色呈强阳性，但未见明显细胞浸润。未服左旋咪唑的兔牛心包片植入体内2周以上，AKP主要集中于心包片中炎症细胞胞膜位置，这与AKP主要定位一致。表明，在心包片植入早期，AKP的来源主要是宿主体液中AKP在局部的浸润沉积，而在中后期则以各种炎性细胞浸润带人的AKP为主。(2)左旋咪唑与钙化：心包片钙化最明显处，AKP染色呈强阳性，而服用左旋咪唑组心包片钙化减轻同时，AKP染色也比对照组浅淡，推测左旋咪唑可能是通过抑制心包片中AKP活性而产生抑制钙化效果，单纯口服左旋咪唑不能完全抑制钙化的发生，采用左旋咪唑液浸泡处理后再植入的牛心包片仍有明显钙化发生。(3)纤维包囊和炎性细胞浸润与生物瓣钙化：植入第4周的心包片均有不同程度的卷曲，表面有纤维包囊包裹，植入时间越长则包囊越厚，在第6、8周有明显纤维包囊包裹的心包片中有大量坏死细胞，同时这些细胞大量聚集的位置也是钙化发生最明显的位置。hc360慧聪网医疗器械行业频道慧聪医疗器械医疗器械医疗设备手术器械保健器材卫生材料
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