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米非司酮对早期妊娠妇女绒毛组织中波形蛋白基因表达的影响

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-05-17 15:19:06

波形蛋白是一种细胞骨架蛋白^[1]，它在维持细胞和细胞器的形态、参与细胞间的信号传导、基因表达和细胞分化发育等方面发挥重要作用^[2，3]。为了解波形蛋白在早期妊娠妇女绒毛组织中的表达情况及米非司酮对其表达的影响，我们采用间接免疫荧光法、免疫组化、胶体金标记、免疫电镜技术，结合Leica-Qwin计算机图像分析系统，定位和检测早期妊娠妇女绒毛组织中波形蛋白的表达情况，并比较米非司酮作用前后的变化，旨在探讨米非司酮抗早孕的机理。一、资料与方法 1．临床资料：2003年4-6月在杭州市红十字会医院妇产科门诊正常早孕要求人工流产的妇女35例，其中15例行负压吸引术流产(对照组)，20例行米非司酮药物流产(药流组)。药流组：孕妇每日早晨口服米非司酮50mg，晚上口服25mg，连续2d，第3天早晨顿服米索前列醇600μg后来院观察，孕囊排出后即刻收集绒毛组织。对照组：行常规负压吸引术流产，收集绒毛组织。 2．方法：(1)免疫荧光染色法：采用间接免疫荧光染色法。另以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照。(2)免疫组化染色法：采用Envision二步法，检测程序按试剂盒说明书进行。另以PBS代替一抗作为阴性对照。(3)胶体金标记：绒毛组织常规电镜标本制备后，鼠抗人波形蛋白1：500过夜，胶体金颗粒标记驴抗鼠IgGlh，染色、免疫电镜观察、摄片。(4)主要试剂：鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(丹麦Dakopatts公司产品)，工作浓度为1：50和1：500；荧光素异硫氰酸盐(FITC)标记的羊抗鼠IgG l：20(美国Sigma公司产品)；即用型Envison试剂盒(丹麦Dakopatts公司产品)；12nm胶体金颗粒标记的驴抗鼠IgG l：100(德国Bayer公司产品)。(5)图像分析：每例连续选取不重叠的20个高倍视野，进行免疫荧光染色图像分析，由Leica-Qwin计算机图像分析系统在相同灰度阈值设定条件下，自动测出整个背景视野的灰度值(GA)、视野内免疫荧光阳性染色灰度值(Ca)。荧光强度灰度值=Ga-GA。 3．判断标准：免疫荧光染色后，出现绿色荧光者为波形蛋白阳性细胞，两组行荧光灰度值测定；免疫组化染色后出现棕色或棕褐色标记物者为波形蛋白阳性细胞。同时观察上述着色细胞的分布。免疫电镜直接观察胶体金颗粒的分布，颗粒分布区域即为阳性，无胶体金颗粒分布区域为阴性。 4．统计学方法：用SAS软件测定并比较各组荧光强度灰度值，进行t检验。二、结果 1．间接免疫荧光法检测结果：阴性对照切片无荧光染色。对照组绒毛间质细胞、血管内皮细胞荧光着色呈阳性，细胞滋养细胞基膜处表达呈强阳性。阳性着色细胞大小、形态不一，多为梭形或线状，少数为斑点状或不规则形。细胞着色部分以细胞浆为主，伸人细胞突起，核区呈空泡状。荧光强度灰度值为180±21。药流组绒毛间质细胞、血管内皮细胞表达强度显著降低，着色细胞明显减少。荧光强度灰度值为75±9，两组比较，差异有极显著性(P<0.01)。两组细胞滋养细胞和合体滋养细胞波形蛋白表达均为阴性。 2．免疫组化法检测结果：两组绒毛间质细胞均有棕黄色颗粒覆盖，而背景呈淡色，阳性细胞分布不均匀，在中轴周边近细胞滋养层基膜处棕黄色颗粒分布浓密。阳性细胞多为圆形或椭圆形，部分细胞有突起。着色以细胞浆为主，呈环形丝状结构密集、均匀地围绕在细胞核的周围，细胞核未见染色。当细胞突起延伸时，胞质内的波形蛋白伸向突起，并随细胞突起延伸。毛细血管壁黄色颗粒着色深，少数毛细血管壁则不染色或染色浅。对照组绒毛间质细胞浆内棕黄色颗粒多、染色深，药流组棕黄色颗粒染色的细胞数及染色强度明显减少。 3．免疫电镜观察结果：对照组绒毛间质细胞胞浆突起较多，可见空泡，有丰富的粗面内质网和线粒体，粗面内质网附近的中间丝沿细胞的长轴呈良好的丝状排列，整齐而致密。胶体金颗粒沿中间丝长轴成簇或散在分布于细胞核与细胞膜间除细胞器以外的细胞质所有部位，胞核呈阴性。药流组间质细胞胞浆突起明显减少，细胞器退化，空泡增多、增大，中间丝显著减少，出现断裂、排列紊乱，胶体金颗粒分布明显稀疏。三、讨论 1．波形蛋白在早期妊娠妇女绒毛组织中的表达：波形蛋白主要存在于间充质来源的细胞以及部分上皮细胞、肌细胞中^[2-4]。本研究结果显示，波形蛋白在早期妊娠妇女绒毛中主要定位于绒毛间质细胞、血管内皮细胞，而在细胞滋养细胞和合体滋养细胞中表达呈阴性，与文献报道一致。本研究还发现了波形蛋白在绒毛中的表达规律：(1)在绒毛中轴周边的间质细胞和部分毛细血管壁表达呈强阳性，阳性表达强度的差异可能与细胞的生长发育阶段有关。(2)阳性着色细胞大小和形态不一，这可能与绒毛间质细胞种类及不同切面有关。(3)波形蛋白较均匀地分布于细胞质中除细胞器以外的所有空间。这与张正治等^[5]的报道一致，但与国外多数学者观察到的结果有明显差异，可能是国外多数学者采用的免疫荧光研究方法，使细胞中稀疏、纤细的结构所发出的荧光较弱而观察不到所致。 2．米非司酮对早期妊娠妇女绒毛组织中波形蛋白基因表达的影响：米非司酮是目前世界范围内广泛应用的抗早孕药物。一般认为，米非司酮既能直接作用于蜕膜，也能直接作用于绒毛。但有关米非司酮对绒毛作用的研究目前多局限于绒毛的滋养细胞，而米非司酮对绒毛间质细胞骨架影响的研究，国内外未见报道。本实验结果显示，米非司酮能显著降低绒毛间质细胞和血管内皮细胞波形蛋白的表达水平，提示米非司酮能直接改变绒毛间质细胞的形态和细胞器的空间排列位置，并使血管内皮细胞变性，影响毛细血管的运动和绒毛的收缩功能^[6]，引起毛细血管扩张、出血，绒毛间隙血流受阻，血栓形成，这可能是米非司酮直接导致绒毛变性、坏死的重要原因之一。hc360慧聪网医疗器械行业频道慧聪医疗器械医疗器械医疗设备手术器械保健器材卫生材料
信息来源：沈忠飞方马荣张梅光等


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