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肝癌细胞中血管内皮生长因子的自分泌及其意义

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-08-19 22:39:43

[摘要] 目的：研究人肝癌细胞中血管内皮生长因子(VEGF)的自分泌及其意义。方法：反转录PCR(RT-PCR)检测体外培养的人肝细胞肝癌细胞系SMMC7721、HHCC和HepG2中VEGF受体的表达。采用人工合成的反义寡核苷酸(ODN)抑制肝癌细胞VEGF的表达后，分别检测肝癌细胞增殖活性和超微结构的变化，流式细胞仪分析肝癌细胞周期以及VEGF受体蛋白表达的变化。结果：VEGF受体1(Flt-1)在SMMC7721细胞中有表达，而HHCC和HepG2细胞则表达VEGF受体2(KDR)。反义ODN对HHCC细胞的增殖有抑制作用，且与ODN的作用浓度呈线性关系，浓度为2.5 μmol／L、5 μmol／L和10 μmol／L时细胞增殖抑制率分别为26％、41％和50％。反义ODN对SMMC7721细胞则无此作用，而正义ODN对上述2种细胞均无作用。反义ODN作用后，HHCC细胞出现S期比率下降，并且在细胞周期曲线中出现凋亡前期峰，而SMMC7721细胞无上述变化。反义ODN能降低HHCC细胞膜表面KDR的表达(阳性率分别为：反义组19.2％，正义组29.8％，对照组31.2％)，对于SMMC7721细胞Flt-1的膜表面表达则无明显影响。结论：人肝癌细胞中存在VEGF的自分泌途径，其机制可能为通过诱导肝癌细胞膜表面KDR的表达及其信号转导作用，从而调节肝癌细胞的分裂增殖。 [关键词] 肝细胞肝癌；血管内皮生长因子；自分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可特异性促进内皮细胞分裂增殖并增加血管通透性。在肿瘤细胞分泌的多种血管生成因子中，VEGF是目前发现的刺激肿瘤血管形成最重要的促进因子，与肿瘤的形成和发展密切相关。人们一直认为，VEGF是以旁分泌的方式调节肿瘤的血管形成，即肿瘤细胞分泌的VEGF选择性作用于肿瘤血管内皮细胞上的特异性VEGF受体(Flt-1和KDR)，并通过酪氨酸激酶介导的信号转导，调控内皮细胞分化和血管形成。但近年研究发现^[1-3]，除了肿瘤血管内皮细胞表达VEGF受体外，多种肿瘤细胞自身也有VEGF受体的表达，而且针对VEGF及其受体的干预措施可以改变这些肿瘤细胞的体外增殖活性和其他生物学特性。以上研究结果提示肿瘤中很可能存在VEGF的自分泌机制。本研究通过检测多种肝细胞肝癌细胞系VEGF受体的表达，并观测反义ODN体外抑制肝癌细胞VEGF表达后其生物学特性的变化，进一步阐明肝癌细胞中VEGF的自分泌机制。材料和方法一试剂及试剂盒 ODN是根据人VEGFmRNA序列第54-74位碱基互补设计而成，由上海博亚生物技术有限公司合成，PAGE纯化。碱基序列为：反义ODN 5′-AGA CAG CAG AAA GTT CATGGT-3′；正义ODN 5′-ACCATGAACTFTCTGCTGTCT-3′，全程硫代磷酸化修饰。人肝癌细胞系SMMC7721、HHCC及HepG2均由本室冻存；小鼠成纤维细胞系L929由第四军医大学口腔生物学教研室提供；人脐静脉血管内皮细胞系ECV304购自中科院上海细胞生物学研究所。RPMI-1640、胰蛋白酶和小牛血清(BCS)均为Hyclone公司产品。RNA抽提试剂、反转录(RT)及PCR试剂盒均购自Gibco公司。MTT为Sigma公司产品。兔抗人Flt-1、KDR单抗，FITC-羊抗兔抗体均购自博士德公司。二细胞培养 SMMC7721、HHCC、HepG2、L929及ECV304细胞均用含10％BCS的RPMI-1640、2.5 S／L胰蛋白酶常规传代培养，5％CO₂培养箱温育。三 RT-PCR分析肝癌细胞系Flt-1、KDRmRNA的表达取上述对数生长期的各细胞系细胞行总RNA的提取(Trizol法)，RT-PCR参照试剂盒说明书操作。引物设计：Flt-1：正链引物：3013-3035，23 mer，5′-CAA GTG GCC AGA GGC ATG GAGTT-3′；负链引物：3487-3510，24 mer，5′-GAT GTAGTCTITACCATC CTGTFG-3′；扩增片段长度：497bp。KDR：正链弓I物：2726-2747，22 mer，5′-GAGGGCCACTCATGGTGATFGT-3′；负链引物：3409-3431，23 mer，5′-TGC CAG CAG TCC AGC ATG GTCTG-3，，扩增片段长度：705 bp。循环参数如下：95℃预变性9分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，30个循环之后，72℃再延伸8分钟。PCR产物经20 g／L琼脂糖凝胶电泳、EB染色后拍照。实验中分别设立空白对照(不加RNA)及各样本的β-actin对照。四肝癌细胞增殖抑制试验将SMMC7721、HHCC和L929细胞接种96孔板，5×10³个／孔，温育24小时待细胞贴壁后，吸去上清液，以无血清RPMI-1640培养液稀释的反义、正义ODN处理细胞，浓度分别为2.5／μmol／L、5 μmol／L和10／μmoL／L，温育48小时，MTF法检测细胞生长情况，与对照组比较，计算细胞存活率(A值百分比)。五流式细胞仪分析细胞周期的变化将SMMC7721和HHCC细胞接种6孔板，2×10⁵个／孔，温育24小时待细胞贴壁后，吸去上清液，以反义、正义ODN处理细胞，方法同前，温育48小时后，消化下来的细胞用2.5 ml的PBS洗涤2次，800-1000r／min离心5分钟，弃上清液，加入1 ml的PBS将细胞混匀，再加入2 ml无水乙醇立即振荡混匀，固定20分钟，PBS洗涤2次，弃除无水乙醇，加100 lLl的PBS重悬细胞，每份待检细胞数5×10⁵-1×10⁶，分别加入DNA-PREPStain 400 lLl，振荡，常温下染色15分钟，上机测定。六肝癌细胞膜表面VEGF受体表达检测SMMC7721和HHCC细胞处理同上，调整细胞浓度为5×10⁶-1×10⁷／ml，取40 μl细胞悬液于小玻璃管中，分别加入兔抗人Fh-1、KDR单抗1μg，再加入20倍稀释的正常灭活兔血清50 μl，4℃温育30分钟，洗涤液洗涤2次，1000 r／min离心5分钟，弃上清液，加入50μl工作浓度的FITC-羊抗兔抗体，充分振荡，4℃温育30分钟，洗涤液洗涤2次，1000r／min离心5分钟，加1 ml固定液，流式细胞仪检测。结果一肝癌细胞中VEGF受体的表达 RT-PCR检测结果：ECV304细胞有明显Flt-1和KDRmRNA的表达，其大小分别为497 bp和705 bp，与预计扩增产物大小一致；SMMC-7721细胞在497 bp处可见较弱的扩增条带，表明有Flt-1 mRNA的弱表达，而HHCC和HepG2细胞无Flt-1 mRNA的表达，但两者在705 bp处出现明显扩增条带，表明HHCC和HepG2细胞有KDRmRNA的表达；L929细胞和空白对照均无阳性条带出现，各样本β-actin对照均在相应位置出现明显扩增条带，表明提取各细胞RNA质量及RT-PCR反应过程良好。二肝癌细胞增殖状况不同浓度反义ODN作用48小时对SMMC-7721和L929细胞存活率(以相对A值表示)无明显影响；而HHCC细胞存活率则明显降低，其中2.5 μmol／L、5／μmol／L和10μmol／L组细胞存活率分别为74％、59％和50％，即细胞增殖抑制率分别为26％、41％和50％，各浓度组与正义ODN和对照组相比均有显著意义(P<0.01)，且抑制作用随反义ODN浓度的增高而增强。正义ODN则对细胞存活率无明显影响。三肝癌细胞周期变化各处理组SMMC-7721细胞周期无明显变化。而HHCC细胞反义ODN处理组S期细胞比例下降，G2期比例有所上升，且出现一小的凋亡前期峰。四肝癌细胞膜表面VEGF受体表达变化流式细胞仪检测结果，SMMC-7721细胞膜表面有Flt-1的表达，其中反义ODN、正义ODN及对照组的阳性百分率分别为20％、21.7％和19.7％，3组间无明显差别。HHCC细胞膜表面有KDR的表达，反义ODN、正义ODN及对照组的阳性百分率分别为19.2％、29.8％和31.2％，其中反义ODN组HHCC细胞膜表面KDR表达的阳性百分率明显低于正义ODN及对照组。讨论目前，越来越多的证据表明，肿瘤中可能存在VEGF的自分泌机制，即肿瘤细胞分泌的VEGF在作用于血管内皮细胞调节肿瘤血管形成的同时，也作用于肿瘤细胞自身，通过某种机制调节肿瘤细胞的分裂增殖。VEGF必须通过其特异性受体才能发挥生物学功能，自分泌途径也不例外。在人类卵巢癌、黑色素瘤、血管瘤、艾滋病卡氏肉瘤、乳腺癌、前列腺癌^[1]、神经胶质瘤^[2]以及膀胱肿瘤^[3]中相继发现：不仅肿瘤血管内皮细胞有VEGF受体的表达，肿瘤细胞中也有Flt-1和KDR的表达(其中多数肿瘤细胞以表达KDR为主)，这是肿瘤中VEGF自分泌机制存在物质基础。本研究发现，肝细胞癌细胞系SMMC-7721中有Flt-1的表达，而HHCC和HepG2细胞有KDR的表达，提示肝癌细胞中可能存在VEGF的自分泌机制。在VEGF的旁分泌机制中，Flt-1和KDR介导VEGF的生理功能有着不同分工。KDR与内皮细胞的分化、增殖有关，Flt-1则与维持内皮细胞之间、内皮细胞与基质之间的粘附有关。在VEGF的自分泌机制中，两者有着相似的功能。很多研究发现，对于有VEGF受体表达的肿瘤细胞，外源性VEGF可以刺激其体外增殖[4]，而通过多种途径抑制肿瘤细胞VEGF的表达后，其体外增殖也同样受到抑制，VEGF的这一自分泌调节功能是通过KDR介导的^[5,6]。有证据表明^[7]，VEGF本身可以上调KDR的表达，且其表达调控是通过KDR受体信号转导系统完成的。结合以上两点，我们可以推测肿瘤细胞中的VEGF及其受体间存在一个正反馈环路，即某些肿瘤细胞分泌的VEGF与肿瘤细胞VEGF受体(主要是KDR)相互作用后，其信号一方面调节肿瘤细胞的增殖、分化，以促进VEGF进一步表达；另一方面又诱导了VEGF受体的表达增高，这样就使VEGF与其受体的相互作用呈正反馈增强。而在这一正反馈环路之外则是VEGF调节肿瘤血管形成这一旁分泌作用的相应增强。也有研究表明，在成人T淋巴细胞白血病中，VEGF可能通过Flt-1介导的自分泌途径使肿瘤细胞的趋化性上调，进而侵犯其他脏器^[8]。本研究通过反义ODN体外抑制肝癌细胞VEGF的表达，进而对肝癌细胞的生物学特性进行观测，结果显示：一定浓度的反义ODN对表达KDR的HHCC细胞体外增殖有明显的抑制作用，并且随着浓度的增大，抑制作用逐渐增强；而对于表达Flt-1的SMMC-7721细胞反义ODN则无明显作用。另外，反义ODN对于HHCC细胞膜表面KDR的表达有抑制作用，说明HHCC细胞分泌的VEGF能上调其受体KDR的表达，反义ODN通过抑制VEGF的表达进而抑制了VEGF对KDR表达的诱导作用；同时，反义ODN对SMMC-7721细胞Flt-1的膜表达无明显抑制作用。因此，我们可以得出如下结论：肝癌细胞表达的VEGF可通过自分泌途径促进自身的分裂增殖，并且这一自分泌机制是通过KDR介导的，HHCC细胞中VEGF与KDR间可能存在一个正反馈环路。在旁分泌机制中，VEGF可通过KDR介导的信号转导系统抑制内皮细胞的凋亡^[9]。在以VEGF及其受体为靶点的抑制肿瘤血管形成实验中发现，在肿瘤血管形成受到抑制的同时，肿瘤细胞的凋亡也相应增多^[10]。由于这些均为体内试验，所以人们一直将肿瘤细胞的凋亡归因于肿瘤血管形成受抑导致的缺氧所致。然而近年研究发现，VEGF可能通过其自分泌机制调节肿瘤细胞分化，抑制肿瘤细胞的凋亡。Baek等^[11]研究发现：缺氧阻断了由血清缺乏引起的肝细胞癌HepG2细胞的凋亡，其机制是通过上调VEGF及其受体KDR的表达实现的。这就提示，VEGF可能以正反馈的自分泌方式抑制肝癌细胞的凋亡。进一步研究发现，外源性VEGF也能阻断由血清缺乏引起的HepG2细胞的凋亡，并且抗VEGF中和抗体和受体酪氨酸激酶抑制剂能抑制缺氧的抗凋亡作用；外源性VEGF的抗凋亡作用是通过诱导ERK磷酸化以及下调Bax／Bcl-2表达比率完成的，由此推断，缺氧诱导VEGF表达所致抗凋亡信号是通过与KDR结合后激活MAPK／ERK通路传导的。Koistinen等^[12]发现，与内皮细胞中的VEGF/KDR信号转导通路相似，急性髓样白血病细胞系OCI／AML-2细胞中KDR介导的VEGF自分泌信号也是通过激活PI-3-K／Akt激酶，进而激活eNOS以维持细胞克隆形成的；进一步利用VEGF、KDR、PI-3-K以及NOS抑制剂抑制NOS的活性，可以抑制OCL／AML-2细胞克隆形成，并在一定程度上诱导细胞凋亡。Bachelder等^[13]研究也发现，体外抑制转移性乳腺癌细胞VEGF的表达诱导了细胞凋亡，这一作用很可能是通过抑制PI-3-K活性而实现的。本研究中，反义ODN作用后的HHCC细胞周期中S期细胞比例下降，且出现一小的凋亡前期峰。这表明VEGF可能通过KDR介导的信号转导系统调节HHCC细胞分化，并抑制其凋亡。因此，反义ODN抑制VEGF表达后，HHCC细胞出现凋亡表现。但本研究中并未见典型凋亡峰和凋亡小体，细胞G1期的比例也未上升，而表现为G2期细胞比例升高，其具体机制有待进一步研究。综上所述，肿瘤中VEGF自分泌机制的研究可使我们对VEGF的生物学功能有一个全面而崭新的认识，并为针对VEGF及其受体的抗肿瘤血管治疗提供充分的理论依据。
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