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子宫胎盘缺血对胎鼠体重及神经系统发育影响的研究

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-09-17 22:09:55

[摘要] 目的探讨不同孕龄孕鼠子宫、胎盘缺血对胎鼠体重及神经系统发育的影响。方法利用子宫动脉钳夹法对妊娠13d(缺血1组)及妊娠17d(缺血2组)孕鼠实施单侧子宫动脉缺血手术，制成孕鼠子宫动脉缺血模型。缺血组孕鼠的另一侧子宫动脉不钳夹为自身对照，相应为对照1组和对照2组。比较缺血组孕鼠子宫动脉钳夹缺血侧，与自身对照组孕鼠子宫动脉不钳夹侧(无缺血侧)的胎鼠体重、脑重及脑组织生长相关蛋白-43(GAP-43)mRNA的表达。结果 (1)缺血1组胎鼠体重、脑重分别为3.2g和0.16g,显著低于对照1组的3.6g和0.18g(P<0.01，P<0.01)；缺血2组的胎鼠体重、脑重分别为3.1g和0.16g，也显著低于对照2组的3.7g和0.17g(P<0.01，P<0.05)。(2)缺血1组和对照1组胎鼠脑组织GAP-43mRNA的表达分别为1.10和1.12，两组比较，差异无显著性(P>0.05)；缺血2组与对照2组胎鼠脑组织GAP43mRNA的表达分别为1.06和1.21，两组比较，差异有极显著性(P<0.01)。结论不同孕龄孕鼠子宫胎盘缺血均会显著抑制胎鼠的生长发育；妊娠晚期宫内缺血使胎脑组织GAP-43mRNA的表达显著减少，可对胎鼠的神经系统发育产生影响。 [关键词] 胎盘；缺血；GAP-43蛋白；胎儿发育孕期子宫胎盘缺血缺氧是导致胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)的重要原因之一。FGR常常与神经系统损伤并存。为了探讨FGR及胎儿脑损伤的发生机制，我们以孕鼠为研究对象，制作不同孕龄孕鼠的子宫胎盘缺血模型。以胎鼠体重、脑重及脑组织生长相关蛋白-43(growth associated protein，GAP-43)的表达为指标，探讨不同孕龄孕鼠子宫胎盘缺血对胎鼠体重和神经系统发育的影响。材料与方法一、动物模型的建立 1．动物：无交配史Wistar大白鼠(由中国医科大学附属第二医院实验动物部提供)，体重220- 350g。以标准大鼠颗粒饲料喂养，室温22℃，相对湿度85％。 2．方法：(1)妊娠确定及分组：将大鼠随机编号后，雌、雄按4：1比例随机于前一天晚合笼，次日晨8时进行阴道涂片，精子阳性者确定为妊娠0日。按受孕顺序随机分为2组：第1组(20只)于妊娠第13天、第2组(20只)于妊娠第17天对孕鼠实施子宫缺血手术。(2)手术方法：以20％水合氯醛按3ml／kg体重作腹腔麻醉，开腹后暴露双侧子宫动脉，以微小动脉血管夹钳夹右侧子宫动静脉和卵巢动静脉，暂时阻断右侧弓状血管的全部血液来源，造成生长于子宫右侧的胎鼠缺血。而左侧子宫动静脉和卵巢动静脉不钳夹，保持生长于子宫左侧胎鼠的正常血液供应，左侧作为自身对照，相应分组为对照1组及对照2组。缺血组30min后取下血管钳，恢复血供(子宫卵巢颜色转红)后还纳子宫，关腹。于妊娠第21天，对缺血组及对照组孕鼠剖宫取胎鼠称重，断头取脑称重后，立即置于-80℃下保存待测。二、GAP43mRNA检测、采用半定量RT-PCR方法测定。提取总RNA后进行cDNA的合成：引物序列参照文献^[1]。进行PCR扩增后其产物电泳，溴化乙啶染色后紫外灯下观察。用kodaklD型凝胶成像系统与β-actin对照，对其扩增产物进行半定量分析(引物由大连宝生物制品有限公司合成)。三、统计学方法所有数据均采用X±s表示，以SPSS统计软件进行t检验及方差分析。结果一、各组胎鼠体重及脑重的比较缺血1组及缺血2组胎鼠体重及脑重均显著低于对照1组及对照2组(P<0.01、P<0.05)，而体重／脑重比值却未见显著差异。二、各组胎鼠脑组织GAP-43mRNA的比较缺血1组与对照1组GAP-43mRNA分别为1.10±0.06和1.12±0.14，缺血1组虽略有减少，但两组间比较，差异无显著性(P>0.05)。缺血2组与对照2组分别为1.06±0.16和1.21±0.09，缺血2组明显减少(P<0.01)。讨论一、不同孕龄孕鼠子宫胎盘缺血缺氧对胎鼠发育的影响大量的研究表明，胎儿宫内发育是序贯的组织器官发育和成熟的过程，可分为细胞数目迅速增加、细胞肥大和功能成熟三个阶段^[2]。已知许多因素影响胎儿生长发育，有遗传、环境、营养因素等。人类胎儿的生长发育曲线显示，妊娠28周以后是胎儿体重增长极其迅速的时期^[3]，脐带血流检测显示，在妊娠28周以后胎盘血管阻力下降、血流增加^[4]，是满足胎儿迅速发育的重要条件。因此，我们选择妊娠中、晚期孕鼠，运用子宫动脉钳夹法制作子宫胎盘缺血模型，探讨妊娠子宫胎盘缺血对胎鼠体重及脑发育的影响。结果显示，无论妊娠中期还是晚期，孕鼠子宫胎盘缺血均会使胎鼠体重及脑重发育显著受到抑制，明显低于非缺血侧的对照组，出现宫内生长受限的结果。体重／脑重比值在缺血组及对照组间未见显著差异。由此推测，钳夹缺血和恢复供血后可能出现缺血再灌注损伤，使胎鼠在恢复血流后仍持续存在供血障碍而表现为宫内生长受限。由此可见，子宫动脉钳夹30min和恢复血流的过程能够模拟慢性宫内缺血，并制成宫内生长受限胎鼠模型。这种模型也是模拟人类胎儿宫内慢性缺血的有效方法之一，这对我们研究人类FGR的病因、病理学及防治等提供帮助。二、宫内生长受限胎鼠脑组织GAP-43mRNA表达的变化及意义 GAP-43是一种钙依赖性酸性蛋白质，主要存在于分化定性并开始轴突生长的神经元中，在脑功能活跃区表达量很高。与脑的发育、神经元的分化及神经联系为基础的某些功能关系极为密切^[4-6]，发育期脑组织GAP-43 mRNA的表达较高，出生后随着神经系统的成熟，它的表达随之降低。许多脑损伤模型都有GAP-43 mRNA表达的变化，因而将GAP-43视为研究神经生长发育和损伤修复的重要标记物之一^[7，8]。而在宫内发育阶段的缺血缺氧对GAP-43mRNA表达变化的影响目前研究较少。本研究中，我们在不同孕龄孕鼠子宫胎盘缺血所致的宫内生长受限胎鼠模型中发现，胎鼠脑组织GAP-43mRNA的表达，在妊娠第13天宫内缺氧后，GAP-43mRNA表达虽略有减少，但与对照组相比差异并不显著。而妊娠第17天宫内缺氧后，GAP-43 mRNA表达则显著受到抑制。分析原因可能有两个：(1)GAP-43作为一种参与神经系统功能完善及损伤修复的蛋白质，在胚胎发育晚期表达明显，因此妊娠晚期的缺血性损伤对其表达的影响较为明显；(2)发育不同时期胎脑组织对缺血缺氧的敏感性可能存在差异。在人类胎儿的脑血流监测中也看到，在妊娠32周以后脑血流阻力下降、血流增加，是确保中枢神经系统发育的重要基础^[4]。妊娠晚期是脑功能完善的重要时期，是否越接近妊娠晚期，胎儿神经系统对缺氧更具有较高的敏感性，更易引起神经系统损伤值得探讨。目前，有关新生儿缺氧性脑病的研究已经取得了很大的进展，而出生前，胎儿在漫长的宫内发育过程中，尤其在慢性宫内缺血并伴有FGR的同时，是否发生神经系统损伤、发生机制及如何防治，则是人们关注的热点。总之，我们的研究发现，宫内发育阶段的缺血缺氧会对胎儿发育产生重要影响，尤其是晚期妊娠的缺血缺氧对胎儿神经系统可能造成一定程度的影响。提示缺血性脑损伤的防治应从宫内开始，本结果为今后的研究提供了依据。(作者：杜鹃尚涛魏轶兵等)
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