[摘要] 目的 利用亚硝基乙基脲(ENU)经胎盘诱发大鼠脑肿瘤的模型，对肿瘤发生前、后各阶段p16蛋白表达进行连续动态观察。方法 对该模型出生后肋60d、90d、120d、150d的子代鼠脑进行p16蛋白免疫组化染色观察。结果 (1)60d组的p16蛋白均表达阳性，无缺失发生；90d组偶有阴性；120d组阳性率下降；150d组阳性率明显下降。瘤周组织的阳性表达率高于瘤内组织。(2)p16蛋白主要定位于细胞核，极少部分定位于细胞浆。结论 (1)随着本模型肿瘤发生率的增加，大鼠脑内p16蛋白的表达下降，说明p16基因突变过程正是肿瘤的发生发展时期，p16基因活动下降与本模型胶质瘤的发生发展有关。(2)p16蛋白定位主要位于细胞核内，极少部分位于胞浆。
[关键词] p16蛋白；神经胶质瘤；免疫组织化学
在胶质瘤的发生发展过程中，p16基因的作用倍受关注，但在哪一阶段发挥作用目前尚无定论。至今有关的实验对象多为已发生的肿瘤个体，或肿瘤细胞，或先天p16缺陷个体，因而无法系统地对肿瘤发生前的基因变化进行观察，对实验对象肿瘤发生前、发生后及进展期的分子生物学变化报道甚少。本研究利用经胎盘诱发脑肿瘤的动物模型，对胶质瘤发生前、发生早期、进展期、后期等各阶段p16变化进行了连续、动态观察。
材料与方法
一、材料：SD大鼠，由北京大学医学部动物室提供；亚硝基乙基脲(Ethyl-nitrosourea，ENU)，购自Sigma公司；Poly-L-Lysine、小鼠p16单克隆抗体购自Santacruz公司、免疫组化试剂盒、DAB试剂盒及微波炉抗原修复工作液均购自北京中山生物公司。
二、方法
1．动物模型的建立[1]：试验组取孕17 d SD大鼠10只，经腹腔内注射ENU(10mg/ml)，剂量为80mg/kg。共产小鼠136只，母乳喂养30 d后雌雄分开。分别于出生后60d(20只)，90d(20只)，120d(20只)，150 d(20只)，在戊巴比妥钠麻醉下，用4％多聚甲醛主动脉灌注固定后取脑。另取孕17 dSD大鼠10只，以生理盐水(70mg/kg)行腹腔注射，其子鼠作为对照组，处死时间及取脑方法同实验组。
2．标本制备：所有标本经固定、脱水、石蜡包埋后，连续冠状切片，厚度10 μm。先行HE及GFAP免疫染色，光镜下判断肿瘤生长情况。然后行免疫组化染色，观察p16在不同时期鼠脑的表达情况。
3．评估方法：(1)每次实验均由预实验选出两张已知p16表达阳性者作为质量控制片，一张加入一抗作为阳性对照，另一张加入0.0l mol／L PBS作为阴性对照。只有两张片子染色效果均满意时，才对同时染色的未知切片进行结果评估。(2)半定量记数分析：阳性细胞记数：在显微镜下观察染色切片，用目镜网格测微尺任选10个视野(400×)，每个视野记数100个细胞，记数其中阳性细胞数，以X±S表示。阳性细胞分级：阳性细胞数≤25标记为l，26-50标记为2，51-75标记为3，>75标记为4，阳性细胞分级，以X±s表示。细胞染色强度分级：阴性：p16蛋白无表达，标记为0；弱阳性：显色较弱，染色细胞散在分布，标记为1；阳性：显色适中，染色细胞较均匀分布，标记为2；强阳性：显色均匀，染色细胞均匀棕黄染色，标记为3。细胞染色强度分级以X±s表示。
4．统计学处理：应用SPSS大型计算机软件对实验组间p16蛋白表达结果进行统计学分析，采用方差分析，检验水准：α=0.05。对150 d组瘤旁及瘤内组织比较采用t检验。
结果
1．肿瘤生长情况：实验组60d、90d组HE染色光镜下观察未发现肿瘤生长。120 d组有8例胶质瘤，占40％；150d组有16例胶质瘤，占80％。
2. p16蛋白免疫组化染色结果：对照组60 d，90d，120d，150d组各20例均阳性，表达率100％。实验组60d组20例均阳性，表达率100％；90d组19例阳性，表达率98.5％；120 d组16例，表达率80％；150d组表达11例，表达率55％。
3．瘤旁组织与瘤内组织的比较150d组中p16表达阳性共11例，其中肿瘤旁阳性而肿瘤内阴性者3例，其余8例肿瘤旁及肿瘤内均有阳性表达，但阳性细胞计数和染色强度均为肿瘤旁高于肿瘤内。
目前的研究表明：p16蛋白是一种特殊的细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂，是细胞周期依赖激酶抑制蛋白基因家族的成员之一。人们普遍认为p16基因的活动在癌细胞中的作用比其它抑癌基因更重要，因为p16在细胞周期的许多调控环节中起到闸的作用。但是，大量的相关研究都是以各种不同组织类型恶性肿瘤的细胞系以及原发肿瘤和转移肿瘤为观察对象，且侧重于p16基因的结构、作用机制和变异类型等[2]。由于实验对象的限制，包括原发肿瘤中究竟是否存在p16基因缺失及p16基因的功能丧失在胶质瘤形成过程中的哪一阶段发挥作用等都存在争议，目前的资料尚无明确认识。因此，有必要对p16基因的活动在肿瘤发生前、发生后不同阶段的变化进行系列观察。
研究肿瘤发生前基因活动的根本困难在于缺乏实验对象。正常人群不一定会发生肿瘤，已发生肿瘤的患者又错过了观察机会。已有的动物模型，如肿瘤移植、后天化学致癌等，也与实验要求存在差距。本实验采用的大鼠胶质瘤动物模型在孕17 d一次性经腹腔给予ENU后，子代鼠出生后90 d前无肿瘤生长，120 d组40％发生了脑肿瘤，150 d组80％发生了脑肿瘤，肿瘤发生的时间、部位、类型与人类相似。同时由于该模型具有一个明显的潜伏期(出生-120d)，这就为观察肿瘤发生前、发生早期及发生后不同阶段的p16基因活动提供了条件。表明经胎盘ENU诱发鼠脑胶质瘤中的p16蛋白变化可以通过免疫组化方法测出。由于采用了p16单克隆抗体，相对提高了实验的特异性。90d组鼠脑正值该模型肿瘤发生前期，免疫组化已经检出p16阴性表达。虽经统计学处理与60d组及正常对照组相比无显著差异，从以后的结果看，有可能正是p16基因突变的超早期阶段。120d组为肿瘤发生的早期，p16蛋白表达阳性率开始出现下降；150d时，肿瘤发生率明显增加，而p16蛋白表达阳性率显著下降。由此说明：随着本模型肿瘤发生率的增加，大鼠脑内p16蛋白的表达下降。p16基因活动下降出现于本模型肿瘤发生的早期，提示p16基因突变过程可能正是肿瘤的发生发展时期，p16基因活动下降可能是引起本模型胶质瘤发生的重要因素之一。
对于原发肿瘤中是否存在p16基因缺失也有争议[3-5],些学者对p16是否原发肿瘤中的抑癌基因提出质疑。认为在体外肿瘤细胞中p16出现高频率的突变或缺失可能与人为因素有关，有可能在体外培养时诱导突变导致了继发改变。我们认为观察对象的不同或观察对象所处的阶段不同可能是导致各家结果不同的原因之一。从理论上分析，肿瘤是不同于正常组织生长方式的异常组织，在其发生发展过程中的不同阶段都可能引起机体的不同变化，反映为基因活性及其表达产物的不同改变。这些改变可能引起多种结果，既可能会促进肿瘤的发展或恶性变，也可能是机体对肿瘤的对抗反应。如果肿瘤的发生与机体的抑癌机制减低有关的话，抑癌基因的表达异常就应该见于肿瘤发生之前。Schlegel等[3]发现本模型的胶质瘤细胞株存在纯合缺失，其观察结果是在肿瘤发生之后。本实验则是在蛋白表达水平观察了肿瘤发生前、后不同阶段的p16活动。结果显示本动物肿瘤模型确实存在p16基因的功能异常，且与肿瘤的发生和发展阶段一致。实验60d组p16蛋白表达全部阳性，提示肿瘤发生前、后的观察结果存在差异，进一步说明连续观察的必要性。
Lowe等[6]在研究中发现，p16蛋白与WAF-1和p53基因一起参与了细胞增殖调节，使细胞终止于G1期关卡，进而诱导细胞凋亡。当p16与p53联合使用后，肿瘤细胞更易于被p53诱导而发生凋亡。本实验室的其他研究已表明野生型p53基因的功能在肿瘤发生前相当长的时间已经丧失[7]，其异常蛋白表达从幼年期直至肿瘤发生后持续异常。而本实验显示p16蛋白的低表达发生在肿瘤发生的早期。说明胶质瘤的发生发展由多种因素参与，多种因素之间可能存在某种内在联系。同一模型中两种抑癌基因的异常存在先后顺序。我们推测与肿瘤发生发展有关的各种基因的活性变化是一连锁过程，肿瘤点燃过程有各种因素参与，而其发展过程中又可能引起基因活动在不同阶段的继发变化。
文献报道瘤组织生物行为较好者表达阳性，反之则表达阴性，这种现象也在本实验中得以证实。p16蛋白表达在正常鼠脑组织细胞核内可见棕黄颗粒，着色清晰，分布均匀。而瘤组织内及瘤旁组织棕黄色颗粒着色不均。正常组织、瘤旁组织高度表达，而瘤内组织低度表达。说明p16蛋白的活动可能与细胞的生物学行为有关。我们推测瘤组织内p16蛋白缺失可能是与肿瘤对抗的结果，而不是点燃因素。
关于p16蛋白在免疫组化中的定位，目前也有争议。Reed等[8]在头颈部鳞癌组织中用免疫组化方法检测p16蛋白水平，发现p16蛋白位于胞核内。而Geradts等对乳腺癌的研究揭示p16蛋白染色阳性者有强胞核型和弱胞质型。本实验发现绝大多数p16蛋白阳性定位于细胞核，极少部分定位于胞质内。我们的经验发现在免疫组化染色前，切片经枸橼酸盐缓冲液充分煮沸抗原修复后，有利于p16蛋白在核内的显示。而抗原暴露不充分可能是导致p16出现胞浆表达假阳性结果的原因。
(作者：张中原 张彦芳)
|
