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反义金属蛋白酶抑制因子-1对肝星形细胞的影响

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-09-17 22:09:55

[摘要] 目的探讨体外构建的反义金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)表达质粒在大鼠肝星形细胞(HSC)中的表达情况及对HSC活化后Ⅰ、Ⅲ型胶原量的影响。方法双酶灌注和梯度离心法分离正常大鼠HSC，培养7-10d后活化为肌成纤维样母细胞表型。应用巢式RT-PCR和基因重组技术构建能在真核细胞中表达的反义TIMP-1质粒并测序鉴定。应用脂质体介导重组质粒和pcDNA3空质粒转染HSC，经含400 μg／ml G418的DMEM培养液筛选3-4周，另设立空白对照组。Northern blot和Western blor检测筛选后的HSC中TIMP-1表达情况；用FITC标记的Ⅰ型胶原为底物测定培养上清液内间质胶原酶活性；应用Westcrn blot方法对HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原进行半定量分析。结果外源重组质粒能较大程度地抑制活化HSC中TIMP-1的表达，而pcDNA3空质粒和空白对照组则无类似结果。TIMP-1／GAPDH比值分别为0.67，2.41和2.97(mRNA水平，P<0.05)。TIMP-1／β-actin比值分别为0.31，0.98和1.32(蛋白质水平，p<0.05)。外源重组质粒转染显著提高了间质胶原酶活性，酶活性分别为0.3049，0.1411和0.1196 P<0.05)。HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原量明显减少。Ⅰ型胶原／β-actin比值分别为0.63，1.78和1.92(P<0.05)。Ⅲ型胶原／β-actin比值分别为0.59，1.81和1.98(P<0.05)。结论反义TIMP-l重组质粒可在HSC中获得稳定表达，并可大幅提高HSC培养液中间质胶原酶的活性，这就有可能提高对Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解能力，减少HSI中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量，从而减少了以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质(ECM)过度沉积，为肝纤维化的逆转提供一个新的思路和方法。 [关键词] 肝星形细胞；TIMP-1；Ⅰ型胶原；Ⅲ型胶原金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)在肝纤维化中的作用正日益受到重视。TIMPs目前有四个成员，与其他成员相比，TIMP-l与肝纤维化发生、发展关系最为密切，肝星形细胞(HSC)在肝纤维化发展中居中心地位。各种损伤和刺激可使静止的HSC活化为肌成纤维母细胞，大量增生并分泌细胞外基质(ECM)和TIMP-1，导致ECM在肝脏内过度沉积。反义技术可用于抑制实验性肝纤维化中靶基因和蛋白的表达。本研究目的在于，应用反义TIMP-1重组质粒宋减少和阻断体外HSC中TIMP-1基因及蛋白的表达，评价反义TIMP-1重组质粒对活化的HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原量的影响。材料和方法 1．大鼠HSC的分离：正常SD大鼠，体重(300±30)g，应用链丝蛋白酶和胶原酶灌注肝脏，以梯度离心液(Ficoll和glycan 1.053，Pharmacia)分离纯化HSC^[1]。细胞纯度通过光镜形态和295 nm维生素A自发荧光观测，约为95％。在5％CO₂，37℃环境中，DMEM(含4 mmol／L L-谷氨酰胺和10％胎牛血清)培养7 d后，HSC活化为肌成纤维母细胞。 2．转染大鼠HSC：HSC培养8 d后，分别用pcDNA3空质粒和反义重组质粒转染细胞。用Trizol提取大鼠总RNA，根据大鼠编码TIMP-1全长cDNA序列设计特异上下游引物，通过巢式RT-PCR技术获得靶序列，应用T4 DNA连接酶连接至T4载体上。经过转化、筛选、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后，将靶片段亚克隆至pcDNA3上(Invitro-gen CA)并测序(PE377自动测序仪)。转染前1天，胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞并计数。细胞吹打均匀后，加入6孔板，密度为1×10⁴/ 孔，以便第2天获得70％融合。应用阳离子脂质体Effectene(Qiagen，德国)作为转染试剂，每孔携带1.0μg反义重组质粒(共12孔)，另设10孔转染pcDNA3空质粒作为对照，严格按操作说明进行。转染5 d后，用含400μg／ml G418的DMEM筛选3-4周。随机从转染反义重组质粒的不同孔中挑选10个neo⁺耐药克隆，同时从转染pcDNA3细胞中选8个耐药克隆作为对照，细胞培养扩增备用。 3．Northern blot检测HSC中TIMP-1表达：细胞扩增后用冰Hank液预洗，Trizol提取细胞总RNA(Life Tech，美国)，RNA浓度通过260 nm吸光度测定。取30μg总RNA，经1％甲醛变性凝胶电泳分离，转移至Hybond-N膜上(Amersham，英国)，80℃固定2 h。将[α^-32p]dCTP(Amersham，英国)以随机引物法标记TIMP-1 cDNA探针，用于检测TIMP-1表达。预杂交3 h，37℃杂交(50％甲酰胺，6×SSC，5×Denhardt液，5 mmol／L EDTA，0.5％SDS，100 μg／ml变性鲑鱼精子DNA)20 h，55℃洗膜20min(2×SSC，1 mmol／LEDTA，0.1％SDS)，50℃洗膜20 min(0.4×SSC，1 mmol／LEDTA，0.1％ SDS)，-70 ℃放射自显影7 d。以GAPDH杂交印记作为内对照。 4．Western blot检测HSC中TIMP-1和Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达：将1×10⁶HSC离心，用冰PBS液冲洗2次，RIPA缓冲液[30 mmol／L HEPES，150mmol／L NaCl，1％Triton X-100，0.1％SDS，1％去氧胆酸(pH 7.6)]在冰上裂解。加入蛋白酶抑制剂-胃酶抑素A(1.0μg／ml)，抑肽酶(3.5 μg／ml)，0.2mmol／L，苯甲基磺酰。经3000 g 4 ℃离心10 min，BCA蛋白质分析试剂盒定量。取100μg蛋白质100 ℃加热5 min后，用12％SDS-PAGE分离并电转移至PVDF膜(Schleicher&Sehuell德国)上，用Tris液(含5％脱脂奶粉和0.1％吐温-20)过夜阻断，Tris液冲洗后，与小鼠TIMP-l IgG单抗(Oncogene)和兔抗鼠Ⅰ和Ⅲ型胶原抗体(用Tris液1：500稀释)室温下孵育2 h，蛋白印迹冲洗后，与AP-耦联的二抗(Santcruz California，美国)孵育。以BCIP／NBT(武汉博士德)显色系统检测条带，以βactin为内对照。 5．酶活性分析：转染和筛选后，接种HSC于6孔板上(10⁵／孔)孵育2周，常规换液并收集培养液。分别取225μl加入25μl DTT(100 mmol／L)，使终浓度达到10 mmol／L，35℃放置30 min，灭活内源性胶原酶抑制剂。用Ⅰ型胶原酶活性分析试剂盒(Chemicon，加拿大)分析酶活性。样本预先与APMA(终浓度1 mmol／L)室温下混合30min，激活潜在的胶原酶，100 μl反应混合物中含50μl(1 μg／μl)FITC标记的Ⅰ型胶原，37 ℃孵育3 h。加入200μl终止液终止反应。6000 g离心10 min，在490 nm激发波长和530 nm发射波长下用荧光计(Hitachi，日本)测样本荧光强度。每样本重复3次，取均值。将每分钟酶解1μl胶原底物所需酶量定义为一个酶单位。 6. 统计学处理：数值用均数工标准差表示，应用方差分析比较不同组间数值差异显著性。P<0.05认为有统计学意义。结果 1．Northern blot检测T1MP-l mRNA在HSC中的表达：在pcDNA3空载体转染组和空白非转染组中，TIMP-l基因的表达水平远高于重组质粒转染组，TIMP-1／GAPDH比值分别为2.14，2.97和0.67(P<0.05)，而在pcDNA3空载体转染组和空白非转染组间，TIMP-l基因的表达水平差异无显著性(P>0.05)。 2．Western blot检测TIMP-1和Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达：TIMP-和Ⅰ、Ⅲ型胶原在重组质粒转染组中的含量显著低于两对照组。各组TIMP-1／β-actin比值分别为0.31,0.98和1.32(P<0.05)。Ⅰ型胶原／β-actin比值分别为0.63 1.78和1.92(P<0.05)。Ⅲ型胶原／β-actin比值分别为0.59，1.8l和1.98(P<0.05)。此外，在pcDNA3空载体转染组和空白非转染组间，TIMP-1和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达差异无显著性(P>0.05)。 3．HSC培养液间质胶原酶活性测定：pcDNA3空载体转染组和空白非转染组中，间质胶原酶活性较为低下。与之相反，重组质粒转染组中酶活性显著增加，三组酶活性值分别为0.3049，0.1411和讨论肝纤维化是多种慢性肝病发展的共同病理结果。ECM的病理性沉积反映了基质蛋白生成与降解之间的失衡、基质金属蛋白酶(MMPs)是一组锌离子依赖的降解胶原和其他ECM成分的酶类；最近研究显示，MMPs参与肝纤维化过程。其中间质胶原酶(MMP-13)主要降解ECM主要成分-Ⅰ、Ⅲ型胶原。MMP-13活性受到特异抑制剂-TIMP-1的调节。研究表明，HSC活化是肝纤维化的中心事件。伴随肝脏损伤，这些窦周细胞增生并发生表型改变，成为肌纤维样母细胞(MFB)，这个过程被称为活化^[2]。以往研究显示，活化的HSC能表达TIMP-1。TIMP-1过度表达能增加实验性肝纤维化程度^[5]。在肝纤维化自发恢复阶段TIMP-1表达明显减少，而间质胶原酶活性明显增加^[4]。从而证实在纤维化发生过程中基质降解受抑制的假说^[5]。反义技术是根据核酸杂交原理设计，以抑制特定基因表达为目的的新技术。反义RNA技术是借助基因重组技术，在靶基因适宜的启动子和终止密码子之间反向插入目的基因，使目的基因DNA得以转录，转染细胞后稳定表达反义RNA，从而在核酸复制、转录及翻译水平高度抑制靶基因的表达，主要包括反义DNA，反义RNA及核酶^[6]。根据这些理论，我们设计了与大鼠TIMP-1 mRNA互补的特异反义序列，构建了能在真核细胞内表达的反义TIMP-1重组质粒。在序列选择与设计时，为尽可能减少非靶序列的扩增，我们采用了嵌套引物策略，采取巢式PCR技术进行两次扩增。对引物局部核苷酸序列作了必要的修饰、调整，以避免引物自身形成“发夹”结构和(或)引物间互成二聚体。pcDNA3是一个由人类巨细胞病毒启动子控制转录起始的表达质粒，含有T7、SP6启动子，为RNA聚合酶附着作用提供了特异性识别位点。pcDNA3还含有SV40启动子、一个多克隆位点，polyA调控序列、抗性基因等结构。其调控的基因可在哺乳动物细胞中获得稳定表达。我们将TIMP-1基因片段反向插入pcDNA3中，构建的反义质粒稳定表达反义TIMP-l RNA后，理论上能在核酸水平高度抑制TIMP-1基因的表达。反义质粒经转染、筛选后，应用Northern blot和Western blot技术评估该质粒对TIMP-l表达的干预效应。结果显示，与pcDNA3空质粒转染组和非转染组比较，反义TIMP-l表达质粒能显著减少细胞内TIMP-1在核酸和蛋白质水平上的表达(P<0.05)。但我们同时也看到HSC中TIMP-1mRNA的表达未能被完全阻断，我们推测还有其他因素参与对其表达的调控。我们选择TIMP-l作为靶点，以便能研究该表达质粒对大鼠间质胶原酶(MMP-13)活性的影响。通过应用FITC标记的Ⅰ型胶原酶活性分析试剂盒，我们发现，在反义TIMP-1重组质粒转染组中，MMP-13活性是空质粒转染组和非转染组的2-3倍(P<0.05)，而对照组之间酶活性差异无显著性(P>0.05)。同时说明pcDNA3空质粒及转染试剂对TIMP-1的表达和MMP-13的活性无明显影响。 Ⅰ、Ⅲ型胶原占健康人肝脏胶原总体的80％，而在纤维化肝脏中则超过95％^[7，8]。Ⅰ、Ⅲ型胶原主要由间质胶原酶降解，因此它们可作为反映胶原代谢的重要参数，用于判断抗肝纤维化治疗的疗效^[9]。Western blot检测HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原量显示，与两对照组比较，反义质粒转染组中Ⅰ、Ⅲ型胶原量显著下降(P<0.05)。一方面可能由于细胞内TIMP-1减少有助于提高细胞内胶原酶活性，增加对Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解；另一方面可能由于TIMP-l具有促生长活性，受抑制后导致包括Ⅰ、Ⅲ型胶原基因在内的效应基因表达减弱。由于MMP-13活性提高能增加胶原降解是已被证实的结论，因此我们未检测细胞培养液中Ⅰ、Ⅲ型胶原的量。以上结果表明，我们所构建的反义T1MP-l质粒能很大程度上减少HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原总量，从而减少了ECM沉积，最终可能起到逆转肝纤维化的作用。我们的体外实验结果显示，pcDNA3／反义TIMP-1重组质粒可通过抑制TIMP-l而起到较强的抗肝纤维化作用。
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