[摘 要] 目的 建立稳定的犬额叶脑出血模型。方法 健康家犬20只，采用新鲜自体动脉血3 ml立体定向一次性缓慢匀速注入左／右额叶皮层，并利用CT、MRI和神经功能缺损评分对模型进行评价。结果 自体血立体定向脑内注入法建立的脑出血模型，术后3 hCT显示血肿大小为(2.78-0.42)ml，MRI能清晰显示血肿及周边组织的病理改变，术后第l-10天Purdy PD评分为(8.12±1.37)-(3.26±1.43)。结论 自体血立体定向脑内注入法建立的犬额叶脑出血模型稳定、可靠，其中注血部位、注血量、注血速度以及注血方式是影响模型成功与否的关键所在。
[关键词] 动物模型；脑出血；犬；额叶
目前，对脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后血肿周边组织是否存在缺血性半暗带及出血性脑水肿形成机制等方面的研究备受关注[1，2]，立体定向手术清除血肿也是近年来外科治疗自发性脑出血的研究热点。本文将采用自体血立体定向脑内注入法建立犬脑出血模型，对注血部位、注血量、注血速度等影响模型成功的关键环节进行研究和探讨。
1材料和方法
1.1 动物选择 选择健康家犬20只(购自河北医科大学实验动物中心)，雌雄不限，体重10-18 kg，平均15 kg。月龄11-24个月，平均18个月。
1.2 脑出血模型制做 采用立体定向自体血脑内注入法。
1.2.1 术前准备 手术前禁食12 h，禁水4 h。术前氯胺酮15mg／kg、阿托品0.04 mg／kg、安定10 mg肌肉注射作为全麻前用药。小腿外侧静脉置入留置针后，以3％戊巴比妥钠40mg／kg缓慢静脉推注。当犬出现呼吸浅慢，角膜反射迟钝，舌外伸时，为麻醉适度表现。如出现呼吸抑制，立即给予尼可刹米0.375 mg静推，挤压胸廓辅助呼吸后可恢复自主呼吸。
1.2.2 CT定位 犬俯卧于CT检查床上，额顶部剪毛后，头部用特殊缚带固定，以两眼外眦连线为基线并用龙胆紫标记，垂直进行扫描(横断位)。扫描参数：层厚5 mm，层距5 mm，视野(FOV)160．电压120 kV，共扫18层面。选择避开鼻窦气腔及侧脑室、清晰显示额叶皮层的扫描层面作为目标注血层面(ScanN)，测量左／右额叶皮层目标血肿部位(C)距额骨外板(A)的垂直距离，额骨外板(A)距颅骨正中线(B)的水平距离，根据以上测量数据确定头皮体表进针点(用龙胆紫标记)和进针深度。进针点即双眼外眦连线后(ScanN×0.5)cm，中线左／右旁开(B-A)cm，进针深度(A-C)cm。
1.2.3 钻颅 犬俯卧于手术台上，头固定于金属下颌托上，消毒、铺巾。以左／右额体表标记进针点为中心，沿前后方向切开长约2-2.5 cm的皮肤切口，逐层分离皮下组织、帽状腱膜、肌肉直至暴露骨面。头部水平套入钻颅定向仪头圈，选择合适的一对定向孔，双侧穿人指示杆(其中上指示杆垂直对准进针点，下指示杆在下位对应点)，上下指示杆卡紧头颅后，用两对固定螺丝固定定向仪头圈，然后从定向孔中撤除指示杆，换插钻头直径为2 mm的充电便携式颅钻。启动颅钻，以钻透颅骨，达硬脑膜为止(有落空感)。撤除颅钻，无菌纱布暂时覆盖伤口。
1.2.4 取血和注血 犬下肢侧卧，充分暴露大腿根部，剪毛，消毒，于股动脉搏动最强点处，用5 ml注射器(针头呈30度角进针)先取新鲜股动脉血4 ml(不抗凝)，立即换用带有刻度的长穿刺针头(此时注意排尽气泡或气血混合液)，沿钻颅定向仪的定向孔进针，将不含气体的3 ml新鲜股动脉血缓慢匀速注入目标血肿区，注射时间5 min，压力<100 mm-Hg。注血完毕后留针10 min。拔针后迅速用骨蜡封骨孔。生理盐水及庆大霉素冲洗切口后，逐层缝合，无菌纱布包扎伤口。青霉素80万U肌肉注射，预防感染。
1.3 模型评价指标
1.3.1 CT 采用TOSHIBA W 1000 CT扫描机。于术后3h，犬再次俯卧于CT检查床上，按注血前的位置、参数和方法再行头颅CT扫描，观察目标血肿区的高信号改变以及有无硬膜下血肿、侧脑室积血。
1.3.2 MRI 采用TOSHIBA VISART 1.5 T超导MR机，头正交线圈(QD)。于术后3 h行头颅MR扫描，扫描序列T1WI、T2WI、FLAIR、T2*WI、DWI、PWI，观察血肿及周边组织信号强度、体积变化以及时间-信号强度曲线变化。
1.3.3 神经功能缺损评分 采用Purdy PD评分标准。于术后第l、3、10天，对脑出血模型犬的意识、行为、转头、转圈及偏盲五方面进行神经功能缺损评分。总得分最低分为2分，表示完全正常，无神经功能缺陷；总得分最高分为11分，表示动物意识丧失或死亡。
2 结果
2.1 造模后CT表现 术后3 h，待血液凝固，血肿形态稳定后，进行头颅CT检查。20只犬在额叶皮层的目标血肿区均有高密度阴影，CT值为(73.5±6.8)Hu，对侧正常脑组织CT值为(46.84±5.4)Hu。按多田氏公式计算血肿体积为(2.78±0.42)ml，血肿形态：类圆形或椭圆形14个，不规则形4个，条带形2个。有气体者l例，硬膜下血肿2例，侧脑室积血2例。
2.2 造模后MR表现 术后3 h，进行头颅MR检查。T1WI血肿区为等信号；T2WI血肿区为等或略高信号，血肿周边区为高信号；FLAIR为高信号；DWI血肿中心区为极低信号，周边区为高信号，T2*WI为血肿区极低信号；PWI时间-信号强度曲线表现为血肿中心区无灌注，血肿周边区低灌注，血肿对侧镜区略低灌注。
2.3 神经功能缺损评分 术后第1、3、10天，Purdy PD评分分别为8.12±1.37、5.64±1.53、3.32±1.46。20只犬均出现了与血肿部位相对应的神经系统定位体征，其中运动障碍表现为血肿对侧下肢瘫痪或以下肢瘫为主的对侧偏瘫。意识状态表现为清醒、嗜睡和昏睡。术后无l例昏迷或死亡。
3 讨论
3.1 模型制做方法 脑出血模型制做方法主要有5种：①自体血注入法；②胶原酶诱导法；③微气囊充胀法；④凝血酶注入法；⑤自发性脑出血。微气囊充胀法只适用于研究脑出血后的占位效应以及模拟血肿清除术后的病理生理变化，因忽略了血肿成分(凝血酶、血红蛋白、血浆蛋白等)对脑损伤和脑水肿的影响，目前该方法已被淘汰。凝血酶注入法只适用于研究血肿成分之一--凝血酶的神经毒性作用，尤其是在出血性脑水肿的产生、发展过程中的作用。自发性脑出血模型，包括易卒中型自发性高血压大鼠(SRHsp)和易卒中型肾血管性高血压大鼠(RHRsp)模型，被认为是高血压动脉硬化性脑卒中最理想的动物模型，但脑卒中类型无法控制，脑出血时的出血量、出血区域无法选择[3]。胶原酶注入法诱发脑出血，虽方法简便，但出血方式主要以弥漫性渗血为主，不能形成真正意义上的血肿，出血灶中常混杂有正常的脑组织(脑岛)[4]，且血肿大小也不易控制，致使模型的稳定性、可控性明显降低。自体血注入法除脑血管无动脉硬化基础外，其血肿形成过程接近人类自然出血过程，因此用自体血注入法建立的犬脑出血模型，最适合进行脑出血实验和影像学研究。
3.2 注血部位 人类最常见的出血部位是基底节-内囊区。但基底节-内囊区靠近侧脑室，侧脑室内的压力较正常脑组织的压力低，因此靠近侧脑室旁基底节-内囊区的血液易破人侧脑室，这是造成注血量与血肿体积存在明显差异的主要原因。基底节-内囊区形成的血肿会导致动物术后严重的神经功能缺损，术后动物护理困难，死亡率较高。本实验采用额叶皮层注血，既能最大限度避免血肿破入脑室从而形成实验所需的有效血肿，又能使动物出现相应的神经系统定位体征而不会死亡，因此是最为理想的注血部位。
3.3 注血量 注血量的大小应视每只动物的脑体积大小而定,物脑体积与其体重的大小不一定成正比。一般而言，注血量过小，不利于CT、MRI对血肿，尤其是血肿周边组织病理变化的影像学观察；注血量过大，易破人脑室，造成注血量与血肿体积不匹配现象，且极易出现严重脑水肿，导致颅压增高、脑疝而死亡，不利于脑出血模型的长期动态观察。如用脱水剂进行干预治疗，就不能了解脑出血后的自然病理生理变化过程，尤其是对脑水肿的观察和研究。本实验曾对犬脑额叶皮层进行2ml、3ml、4ml注血量耐受力实验，当注血量≥4ml时，血液极易破入脑室系统，动物很快出现中枢性呼吸循环衰竭而死亡，而注血量为3ml时，模型效果较为满意。
3.4 注血速度 注血速度过慢，血液易在在针头和针管内凝固；注血速度过快，血液易顺针道逆流形成硬膜下血肿、继发性蛛网膜下腔出血或血肿破人脑室系统。Yang等[5]认为注血时间5 min，注血压力<100 mmHg是模型成功的关键因素，这在本实验过程中也得到充分证实。
3.5 注血方式 在人工注血时，有时注血时间、注血压力难以精确把握。一方面，当注血速度稍快，仍有可能血液顺针道溢出或进人脑室。为解决这一问题，Deinsberger等[6]采用二次注血法，首次注血血液凝固阻断针道的回路，二次注血就可产生急性血肿，两次间隔10 min。但有研究认为，脑血管破裂后，通常是一次性出血，血液流出的持续时间一般为20-30min，极少发生继续出血或再出血的现象。二次注血法不符合脑出血的自然过程，且增加反复股动脉抽血时，血液中混杂气体的机会。另一方面，当注血速度稍慢时，血液易在针头处凝固，Xi等[7]采用动脉血+肝素的方法解决这一问题，但肝素为抗凝剂，会干扰血肿自然凝固过程，未肝素化的动脉血在24 h内形成的血凝块会引起血浆蛋白凝集的级链反应，刺激产生快速和持久的脑水肿；而肝素化的动脉血则不会引起脑水肿的发生。因此，只有一次性注入不抗凝的新鲜自体动脉血，才符合人类脑出血的自然过程。我们在反复实践中摸索出，除注意掌握注血时间5 min，注血压力<100mmHg外，注血完毕后留针10 min非常重要，这样可使注入的血液处于凝固或半凝固状态，解决了顺针道逆流形成硬膜下血肿的问题。
3.6 影像学评价和神经功能缺损评分 长期以来，CT一直是脑出血首选的影像学检查方法，在出血即刻就可发现颅内异常的高信号改变。由于出血灶中血红蛋白变化的复杂性，常规MRI对脑出血并不敏感[8]，近年来，随着功能性磁共振(fMRI)和快速成像技术(EPI)的迅速发展以及MR设备的不断更新，MRI的应用领域不断拓宽，这使应用MRI对脑出血血肿及其血肿灶周病理生理变化的研究成为可能。本实验应用CT、MRI对犬脑出血模型进行评估的结果显示：术后3 hCT目标血肿区表现为高密度阴影，血肿体积为(2.78±0.42)ml，与注血量基本相当，硬膜下血肿和脑室积血的发生率相对较低。MRI表现为T1WI血肿为等信号；T2WI血肿区为等或略高信号，血肿周边区为轻度高信号水肿；FLAIR为变化同T2WI；DWI血肿区极低信号，T2*WI血肿区极低信号，周边薄层高信号；PWI时间-信号强度曲线表现为血肿中心区无灌注，血肿周边区低灌注，血肿对侧镜区略低灌注。也就是说，常规MRI结合fMRI能够清晰显示血肿及其血肿周边组织的缺血性损害以及血管源／细胞毒性水肿的病理变化过程。模型犬术后第l天神经系统症状最重，3天后症状开始明显减轻，10天时基本恢复正常或仅遗留下肢轻瘫，第l、3、10天Purdy PD评分分别为8.12±1.37、5.64±1.53、3.32±1.46，动物无一例死亡，存活率较高。
本文采用白体血立体定向脑内注入法建立犬脑出血模型，注血部位选择额叶皮层，注血量选择3 ml，注血时间5min，注血压力<100 mmHg，注血方式选择一次性注入不抗凝自体血，同时注意留针10 min。造模后CT显示额叶皮层形成有效血肿，MRI显示血肿及其周边组织有特征性改变，神经功能表现为中-轻度缺损。结果表明采用该方法和技术指标能够建立稳定、可控、长期存活并适合影像学研究的脑出血模型，为今后开展脑出血血肿及其血肿灶周病理生理变化的实验和MR影像学研究奠定了基础。hc360慧聪网医疗器械行业频道 慧聪医疗器械 医疗器械 医疗设备 CT B超
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