[搞要] 目的 观察重组人内皮抑素腺病毒(Ad／hEndo)对人肝癌裸鼠移植瘤生长的影响。
方法 脐静脉内皮细胞ECV-304经Ad／hEndo感染后，western印迹检测人内皮抑素的表达。人肝癌BEL-7402细胞移植到裸鼠背脊部后，检测Ad／hEnd。对肝癌移植瘤生长的抑制作用。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中内皮抑素mRNA的表达。分析人内皮抑素在裸鼠体内的表达分布。
结果 Western印迹检测到人内皮抑素基因在ECV-304细胞内高效表达。Ad／hEndo明显抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤生长(F=4.061，P<O.05)。Ad／hEndo组血管密度计数为6.88±1.08，DMEM组为13.60±1.71(t=9.216，P<0.01)。瘤内注射Ad／hEndo后3 d，RT-PCR在肿瘤组织检测到内皮抑素mRNA的表达，7d后表达不明显。人内皮抑素蛋白主要分布在肿瘤组织。
结论 腺病毒介导的人内皮抑素基因在体内、体外获得高效表腺病毒。
血管生成抑制剂内皮抑素(endostatin)已进入临床I，Ⅱ期试验，初步的临床研究表明，应用内皮抑素进行抗肿瘤血管生成治疗需要反复、长期用药。而采用基因转导方法，将人内皮抑素基因导人人体，体内获得较长时间、高质量的治疗蛋白表达，是一种有前途的抗血管生成治疗方法。腺病毒载体是常用基因转导载体之一，对其E3区序列进行修饰，重新加入修饰后部分E3区序列，可成功降低病毒载体的免疫源性。利用新的病毒载体，构建表达分泌型人内皮抑素基因的重组腺病毒(Ad／hEndo)，观察其对肝癌裸鼠移植瘤生长与血管生成的影响。
材料和方法
一、材料
1、细胞系、病毒：人肝癌细胞BEL-7402由中山大学肿瘤防治中心保存，人脐静脉内皮细胞ECV-304、5型腺病毒E1区基因转化的人胚肾上皮细胞293购自中国科学院上海细胞生物学研究所。携带人内皮抑素基因的第二代重组腺病毒(Ad／hEndo)以及携带LacZ基因的重组腺病毒(Ad／LacZ)自行构建。用293细胞扩增腺病毒，经氯化铯梯度离心纯化，病毒滴度用空斑形成单位(plaque-forming unit，PFU)表示。
2、实验动物：Balb／c裸鼠，雄性，4-6周龄，体重20-24g，由中山大学医学院动物实验中心提供，饲养于无特殊病原环境。
3、主要试剂：内皮抑素酶联免疫吸附实验(en-zyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(美国Oncogene公司产品)，兔抗人内皮抑素多克隆抗体(美国Chemicon International公司产品)，抗Ⅷ因子单克隆抗体(美国Dako公司产品)，Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司产品)。
二、方法
1、Western blot检测人内皮抑素蛋白的表达：用感染复数(multiphcity of infection，M01)为20的Ad／hEndo感染ECV-304细胞，对照组加入磷酸盐缓冲液，2h后吸弃病毒悬液，加入培养液，在37V、体积分数为5％C02条件下培养。分别于24、48、72、96、120、144、168、180h后收集细胞裂解液各50ul，经10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到硝酸纤维素膜，蛋白封闭液封闭膜30min；一抗为兔抗人内皮抑素多克隆抗体(1:400)，4℃孵育过夜，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体(1:1000)，室温孵育2h，化学荧光显色。
2、Ad／hEndo抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长：将含有5× 106／ml的BEL-7402细胞悬液0.2ml注射到裸鼠腋部皮下，2周成瘤。无菌取出肿瘤，浸入等渗盐水，剪成直径1.5ml的碎块，接种到裸鼠皮下，1周后，肿瘤苴戤0.5cm-0.7cm时，随机分组：治疗组(8只)瘤内注射l × 109PFU／只的Ad／hEndo 100Ul，腺病毒对照组(8只，瘤内注射1 × 109PFU／只的Ad／LacZ 100U1)，空白对照组(7只，瘤内注射DMEM：液100u1)。3d后测肿瘤大小。瘤内注射每周1次，共6次。治疗结束后1周，处死裸鼠，取肿瘤称重，计算抑瘤率，抑瘤率二(对照组瘤重-实验组瘤重)÷对照组瘤重× 100％。以T／C值作为评价指标，评价标准按Fodsta法[6]：肿瘤体积：V=宽2×长× 0.5(单位cm3)。T／C计算公式为：T／C=实验组(vt／Vo)÷对照组(vt／vo) × 100％(Vo为开始给药时测量的体积，Vt为td时测定的体积)。
3、肿瘤血管密度(microvessel density，MVD)测定：取末次治疗后l周的肿瘤组织，石蜡包埋、切片，抗VmⅧ因子抗体染色。低倍镜下寻找高血管密度区，即"热点"，再在中倍镜下计数被抗VmⅧ因子抗体染成棕色的血管数目。取3个视野的平均数。
4、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测肿瘤组织中人内皮抑素mRNA的表达：取第6次治疗后3d、7d的肿瘤组织。RNA提取按照Trizol试剂盒说明书
操作。经15g／L琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量后，保存于-70℃备用。根据人内皮抑素cDNA序列设计引物(上游引物：5/-ACTTCC AGC CGGTGCTCC A-3/：下游引物：5/-GAT GGC AGC TCGCGG CAC T-3/)，由上海亚博生物技术有限公司合成，此引物扩增产物划、为486bp。用D-actin引物(上游引物：5/-GGATTC CTA TGT GGG CGA CG-3/：下游引物：5/-GGA ACC GCT CATTGC CAATG-3/)作为内对照以检验cDNA的质量和整个PCR操作过程的可靠性，此引物扩增产物约为617bp。cDNA合成反应：A管：OUgo(dT)20 1Ul、总RNA提取物1.5ug，加DEPC水至总体积10ul。65℃，5min后置冰上。B管：5×cDNA合成缓冲液4Ul，0.1mol／L DTTlul，40u／ul RNA酶1ul，10mmol／L dNTP混合物2ul，15U／ul Thermoscript RT 1ul，加DEPC水至总体积10ul。将A、B两管混合进行反应，条件：50℃60min，85℃5min，加lu1 RNA酶抑制剂，37℃温育20min。20℃保存或即用于PCR反应。PCR扩增按PCR试剂盒(日本Takara公司产品)说明书进行。扩增产物经15g／L琼脂糖凝胶电泳检测。
5、人内皮抑素蛋白在组织中的含量：取肿瘤、内脏(心、肝、脾、肺、肾)组织样本，称重、剪碎，加入Tris缓冲盐溶液1.5ml，超声粉碎，5 000×g离心5min，取上清液50 ul，ELISA法测定上清液中的人内皮抑素蛋白浓度。上清液样本稀释500倍后，分光光度仪测定总蛋白含量。组织样本内皮抑素含量(ng／mg)=内皮抑素浓度(ng／m1)／总蛋白含量(mg／m1)。
6、统计学处理：采用SPSSl0.0统计软件，进行t检验、方差分析。
结果
1、人内皮抑素蛋白的检测：Western印迹检测Ad／hEndo感染不同时间后细胞裂解液中人内皮抑素蛋白显示：感染细胞24h后表达人内皮抑素蛋白，在120h达到高峰，并持续到180h，说明Ad／hEndo在ECV-304细胞获得高效及长时间的表达。
2、Ad／hEndo体内抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长：治疗后24d T／C比值(Ad／hEndo组：DMEM组)为48.10％，治疗结束1周为41.34％。Ad／hEndo治疗组、Ad／LacZ组、DMEM组瘤重分别为(0.773 8±0.4269)g、(1.446 3±0.551 0)g、(1.5043±0.6974)g，F=4．061，P<0.05。说明Ad／hEndo明显抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的生长。
3、Ad／hEndo对肿瘤血管生成的作用：Ad／hEndo治疗组MVD为6.88±1.08，DMEM组MVD为13.60i1.71(t=9.216，p<0.01)。治疗组肿瘤微血管密度计数明显少于对照组，说明Ad／hEndo对肿瘤微血管生成有明显抑制作用。
4、RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，可见大小为486bp左右的人内皮抑素mRNA特异条带和617bp左右的B-actin内对照条带，均符合设计的片段大小。结果显示，在第6次治疗后3dg中瘤组织中检测到人内皮抑素mRNA的表达，而7d后无明显表达。
5、人内皮抑素蛋白体内分布分析： Ad／hEndo第6次治疗后7d，治疗组肿瘤组织中人内皮抑素蛋白含量高于对照组(F=17.801，P<0.05)，而治疗组与对照组中的内脏(心、肺、脾、肝和肾)内皮抑素含量差异不明显。说明瘤内注射Ad／hEndo后，转基因表达的人内皮抑素蛋白主要分布在肿瘤组织局部，而内脏组织(心、肺、脾、肝和肾)的含量很低。
讨论
抗血管生成治疗通过抑制肿瘤血管生成达到抗肿瘤生长与转移的目的，而肿瘤血管生成的抑制是一个长期、慢性的过程，因此需要长期、持续地应用血管生成抑制剂。内皮抑素的半衰期为(10.7×4.1)h需要每日给药，这给患者带来极大不便。而且内皮抑素蛋白性质不稳定，蛋白制备、纯化困难，获得大量的治疗蛋白成本高.
基因治疗可克服以上问题，而采用质粒、双岐杆菌等基因载体转导效率欠佳.因此采用新的腺病毒载体(E1区和部分E3区缺失)以在ECV-304细胞内获得高效、较长时间(一周以上)的内皮抑素蛋白表达，在肿瘤组织内检测到内皮抑素mRNA的表达。然而，体内基因表达是短暂的，Ad／hEndo瘤内注射后3d，在肿瘤组织中可以检测到内皮抑素mRNA的表达，在7d后已经基本消失。因此，内皮抑素基因治疗仍需要间断、反复治疗。
采用肿瘤局部用药的方法，每次注射1X109PFU的Ad／hEndo，每周1次，连续6次。治疗结束后，抑瘤率为46.50％(Ad／hEndo组对Ad／LacZ组)和48.56％(Ad／hEndo组对DMEM组)，取得一定的抑瘤效果，这与多数学者报道的腺病毒基因治疗结果相似[3,11]。采用基因治疗策略在动物实验中并没有取得蛋白药物完全缓解的效果。其原因可能与蛋白不同来源有关，蛋白治疗药物是从大肠杆菌、酵母菌等提纯的部分变性蛋白，而基因治疗是在体内表达内皮抑素基因的部分序列，两者可能有不同的生物学特性。
腺病毒载体宿主细胞类型广泛，既可以感染分裂期的细胞，又可以感染非分裂期的细胞，在多种肿瘤细胞都可获得高效表达。腺病毒载体这一特征为Ad／hEndo进行肿瘤局部治疗(如瘤内直接注射治疗、经动脉局部灌注)提供了理论基础。局部应用Ad／hEndo可望增强局部抗肿瘤生长的作用，提高基因治疗的靶向性。对Ad／hEndo治疗后肿瘤组织和内脏中内皮抑素蛋白含量进行分析，也表明Ad／hEndo瘤内注射后内皮抑素主要在肿瘤局部高效表达，这为临床开展Ad／hEndo局部治疗提供了依据。
医疗器械商务网 医疗信息 医疗厂商 医疗 医械 器械信息 器械厂商 器械
|
