[摘要] 目的 探索同种异体角膜缘移植排斥反应规律及FK506眼液的免疫抑制作用。
方法 48只新西兰白兔随机均分成FK506组、环孢素A组及非治疗组，建立右眼角膜缘缺陷症动物模型，1个月后行同种异体角膜缘移植术，术后分别用0.5％FK506眼液、1％环孢素A眼液及生理盐水滴眼4周。角膜缘移植术前1 d，术后2、4周分别进行角膜中央印迹细胞学检查；术前1 d及术后1-8周动态监测外周血T淋巴细胞CD25的表达；移植术后每日观察植片存活、角膜新生血管和上皮再生情况，共10周；分别取术后第4、8及10周的角膜缘植片观测淋巴细胞浸润及T淋巴细胞上CD25的表达。
结果 角膜缘创伤后1个月，所有兔眼角膜中央印迹细胞学检查均为结膜表型；同种异体角膜缘移植术后4周，FK506组和环孢素A组角膜中央保持角膜细胞表型，非治疗组呈结膜细胞表型。非治疗组最早出现上皮排斥反应，FK506与环孢素A均可抑制排斥反应的发生，停药后环孢素A组先于FK506组出现上皮排斥反应(p<0.05)。FK506组外周血、角膜缘植片T淋巴细胞CD25表达及角膜缘植片中淋巴细胞浸润程度低于环孢素A组，两组均低于非治疗组(p<0.05)。
结论 同种异体角膜缘移植术后早期应用0.5％FK506眼液滴眼可抑制外周血及植片T淋巴细胞CD25的表达从而抑制排斥反应发生，其作用强于1％环孢素A眼液。
随着人们对角膜缘干细胞生物特性及临床应用认识的不断深化，同种异体角膜缘移植已成为目前治疗严重角膜缘缺陷症的重要手段。但术后移植排斥反应仍是该手术成功的最大障碍。寻找新型、高效、安全的免疫抑制剂成为提高该手术成功率的重要措施之一。本实验于2000年6月至2001年4月以兔为研究对象，观察了FK506眼液对同种异体角膜缘移植术后排斥反应的免疫抑制效果。
材料和方法
一、实验动物
取健康新西兰白兔48只作为受体，健康灰兔16只作为供体，雌雄不限，体重为2.0-2.5 kg。所有实验用兔均购自中山大学动物实验中心，使用前检查无眼部疾患。48只受体新西兰白兔随机分成FK506组、环孢素A组及非治疗组，每组16只兔。
二、角膜缘缺陷症动物模型的制备
右眼为实验眼。常规麻醉、消毒、铺巾、开睑。剪除角膜缘后约3 mm球结膜及Tenon囊，板层切除约3 mm宽周边角膜和角膜缘组织。刮除角膜上皮。术后每日局部应用庆大霉素眼液及四环素眼膏，裂隙灯检查眼表情况，术后1个月行同种异体角膜缘移植。
三、同种异体角膜缘移植
1、植片制备：供体兔处死后用11-12 mm直径环钻在角膜缘内1 mm透明角膜上作深约0.1-0.2mm浅层划界；于角膜缘外2 mm剪开球结膜及Tenon囊，暴露巩膜；用剃须刀片在巩膜上行相同深度的浅层划界，板层剖取含有1 mm透明角膜和2 mm角膜缘的植片。植片大致平均分成3片，每片约3 mm ×12 mm。上皮面向上平铺于BSS浸润的纱布上待用。每只受体眼移植2小片植片，分别置于上下方植床。因此每只供体兔提供的植片为3只受体兔移植。
2、手术方法：清除角膜表层新生血管膜样组织，暴露平整的角膜缘，刮除不正常的角膜上皮。每只受体眼移植2片植片，分别置于上下方植床，10-0无损伤缝线间断缝合角膜侧与球结膜侧(与巩膜缝合)。球结膜侧与术眼切除结膜的残缘保留2 mm隔离区。
3、术后治疗：FK506组滴用0.5％FK506眼液，环孢素A组滴用1％环孢素A眼液(0.5％FK506眼液及1％环孢素A眼液均购自中山大学中山眼科中心)，非治疗组给予生理盐水，均为3次／d，共4周。
四、眼表观察
术后每日观察上皮再生情况、眼表平滑度、透明度、植片存活、角膜新生血管等，共10周。同种异体角膜缘移植术前1d、术后2、4周分别对角膜中央进行印迹细胞学检查。检测指标：(1)角膜新生血管指数：无角膜新生血管为1分；新生血管位于角膜缘内2 mm为2分；角膜周边新生血管≤1／2象限为3分；角膜周边新生血管>1／2象限为4分；全角膜新生血管为5分。(2)上皮排斥反应发生时间：上皮排斥反应以典型的上皮排斥线为指标，记录出现时间。(3)移植片排斥反应(水肿混浊)指数[4]：无水肿混浊、角膜透明为1分；轻度水肿混浊、虹膜纹理可见为2分；中度水肿混浊、虹膜纹理不清为3分；移植片部分溶解为4分。
五、外周血T淋巴细胞CD25表达的动态监测
移植术前1 d及术后1-8周分别采取抗凝全血2 ml，提取其单个核细胞。涂片后采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase arch alliance procedure，APAAP)法进行标本染色：一抗为鼠抗兔CD25单克隆抗体，二抗为羊抗鼠IgG，三抗是APAAP复合物，最后加APAAP底物显色。高倍镜下观察，细胞核呈蓝色、细胞表面有红色标记物者为阳性细胞，无红色标记物则为阴性细胞。随机计数100个单个核细胞
中阳性细胞数，重复3次，取平均值。
六、免疫组化检查
每组于术后4周随机取5只兔，术后8周随机取6只兔，处死后立即剪下受眼的角膜缘植片制作冰冻切片。HE染色2张，光镜下随机计数植片中央区5个400倍视野中淋巴细胞的数目，取其平均值进行淋巴细胞计数。其余切片进行免疫组化染色：一抗为小鼠抗兔CD25单抗，二抗为生物素标记山羊抗小鼠IgG，三抗为辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，二氨基联苯胺(diaminobenzidin，DAB)显色。细胞膜有棕褐色着色的细胞为阳性细胞。随机计数植片中央区5个高倍视野(X400)中阳性细胞的数目，取其平均值。
七、统计学方法
本研究采用SPSS 8.0软件进行数据统计。对同种异体角膜缘移植术后角膜新生血管指数及同种异体角膜缘移植术后移植片排斥反应指数的比较采用x2检验和秩和检验，对术后上皮排斥反应发生时间及淋巴细胞数目变化的比较采用单因素方差分析和t检验。
结果
一、眼表表现
全周角膜缘组织切除并去除角膜上皮1个月后，所有兔眼均出现不同程度角膜新生血管化、角膜结膜化、上皮水肿混浊；角膜中央印迹细胞学检查呈结膜细胞表型。3个组间同种异体角膜缘移植术前角膜上皮水肿混浊指数及角膜缘新生血管指数比较，差异均无显著意义(x2=1.14，0.26；p>0.05)。
同种异体角膜缘移植术后早期，所有植片均成活，术后4 d即有
角膜上皮生长，荧光素着色面逐日缩小，角膜上皮于术后7-14 d愈
合，平均(9.5±2.7)d。术后2周，角膜中央印迹细胞学检查为角膜上皮细胞表型。随着上皮排斥反应的发生，各组先后出现角膜缘植片不同程度水肿混浊、植片部分溶解、角膜新生血管增加及角膜结膜化。移植术后4周，FK506组和环孢素A组角膜中央印迹细胞学检查仍为角膜上皮表型；而非治疗组出现上皮排斥反应后印迹细胞检查为结膜上皮表型，高碘酸-Schiff染色(periodic acid-schiff stain，PAS)阳性，出现杯状细胞。
1、同种异体角膜缘移植术后角膜新生血管指数比较：术后4、8及10周角膜新生血管指数比较，差异有显著意义(X2=12.80，21.50，13.39；p<0.05)；其中非治疗组角膜缘新生血管指数高于环孢素A组(z=-2.85，-2.87，-3.15；p<0.05)和FK506组(z=-3.25，-2.60，-3.11；p<0.05)，环孢素A组与FK506组比较，差异无显著意义(z=-0.53，-0.96，-1.56；p>0.05)。
2、同种异体角膜缘移植术后上皮排斥反应发生时间比较：非治疗组、环孢素A组及FK506组术后上皮排斥反应发生时间分别为(19.8±5.7)、(46.5±40)及(62.2±2.6)d，其中环孢素A组及FK506组与非治疗组比较，差异有显著意义(F=211.38，P<0.01)；两两比较，非治疗组植片排斥反应发生时间早于FK506组(q=50.43，p<0.05)和环孢素A组(q=31.71，p<0.05)，环孢素A组早于FK506组(q=18.71，p<0.05)。
3、同种异体角膜缘移植术后移植片排斥反应指数比较：术后4周移植片排斥反应指数比较，3组植片排斥反应指数差异均有显著意义(X2=45.38，p<0.05)；两两比较，非治疗组植片排斥反应指数比FK506组(z=-5.29，p<0.05)和环孢素A组高(z=-5.29，p<0.05)，环孢素A组与FK506组差异有显著意义(Z=0.00，p>0.05)。术后8周移植片排斥反应指数比较，差异有显著意义(X2=25.81，P<0.05)；两两比较，非治疗组植片排斥反应指数比FK506组(Z=-4.31，P<0.05)和环
孢素A组高(Z=-2.27，P<0.05)，环孢素A组高于FK506组(Z=-4．34，P<0.05)。术后10周移植片排斥反应指数比较，差异有显著意义(X2=11.11，P<0.05)；两两比较，非治疗组植片排斥反应指数高于FK506组(Z=-2.90，P<0.05)和环孢素A组(Z=-2.25，P<0.05)，环孢素A组高于FK506组(Z=-2.00，P<0.05)。
二、同种异体角膜缘移植术后不同时间表达CD25的外周血T淋巴细胞数目.
3个组移植术前表达CD25的外周血T淋巴细胞数值比较，差异无显著意义(F=1.13，P=0.28)。术后各组表达CD25的外周血T淋巴细胞数均有不同程度升高。术后2周起，3个组比较，差异有显著意义(F=58.46，326.18，139.33，45.47，28.39，20.33，19.32；P<0.01)，非治疗组数值最高、环孢素A组次之、FKS06组最低。
移植术后4、8、10周3个组角膜缘植片中淋巴细胞数目及表达CD25 T淋巴细胞数目比较，均以非治疗组数值最高、环孢素A组次之、FK506组最低。
角膜缘干细胞位于角膜缘基底部，其概念是由Schermer等于1986年应用免疫组化技术首次提出。角膜缘干细胞的高增殖潜力在角膜上皮细胞缺损修复中保证了角膜样上皮细胞的特征。角膜缘干细胞缺损的扩大导致不足够角膜上皮再生时，角膜上皮愈合出现障碍，结膜上皮移行到角膜表面，同时伴有角膜血管化，慢性炎性反应、复发性上皮糜烂及持续性上皮缺损、瘢痕与假性胬肉的形成。目前，同种异体角膜缘移植术是治疗该病的重要手段。但是由于角膜缘干细胞位于血管和淋巴管丰富以及HLA-DR抗原和Langerhan细胞密集的角膜缘，因此角膜缘不是免疫赦免区，角膜缘部密集的Langerhan细胞可以把异体抗原提呈给T淋巴细胞，同时又增强干细胞表面HLA-DR抗原的表达。表达在T淋巴细胞表面的抗原分子CD25是白细胞介素2受体(1L-2R)。高亲和力的IL-2R的表达对早期T细胞的分化成熟有重要的促进作用。表达CD25的T细胞与IL-2相互作用为活化T细胞的克隆提供了重要信号，在移植排斥反应中起重要作用，因此IL-2R的表达是辅助性T细胞活化和细胞免疫反应启动的重要标志。所以角膜缘是免疫排斥的高危区域，免疫排斥反应是同种异体角膜缘移植术后面临的最大难题。目前皮质类固醇是临床较常用药物，但其治疗效果却不尽如人意，并且长期使用可出现激素性白内障、青光眼等副作用；环孢素A使角膜移植的预后有所改观，但对高危眼角膜移植效果欠佳，排斥反应仍有发生。新一代高效免疫抑制剂FK506的问世为同种异体器官移植带来希望，临床已应用于肝、肾等器官移植，效果显著。但FK506全身用药存在许多副作用，因此在眼科应用较少。本实验旨在通过动物模型初步探讨FK506眼液对同种异体角膜缘移植免疫排斥反应的抑制效果，并与环孢素A眼液比较。
FK506是一种免疫抑制剂，其作用机理与环孢素A相似，通过抑制T11细胞释放IL-2、IL-3、IFN-r等多种细胞因子的活性以及IL-2受体的表达来抑制T淋巴细胞活化和增殖从而抑制免疫排斥反应的发生，作用明显强于环孢素A[10,11]。本研究结果表明，同种异体角膜缘移植术后早期应用0.5％FK506眼液可有效抑制免疫排斥反应，与1％环孢素A眼液相比，可延长植片存活时间，降低植片排斥反应发生率，其免疫抑制作用强于环孢素A。但在抑制角膜新生血管发生方面与环孢素A比较并无明显差别。
本研究对角膜缘植片进行组织病理学检查，结果表明，排斥反应可能最早都是从角膜的手术创伤和缝线等造成的非特异性刺激开始的。在未出现排斥反应之前，在角膜缘伤口和缝线周围就已经持续
出现炎性反应。这些非特异性刺激吸引巨噬细胞、淋巴细胞在其周围集聚。聚集在伤口和缝线周围的巨噬细胞会将供体角膜的异体抗原提呈给受体，从而激活T。细胞，所产生的细胞因子进一步促进同种异体抗原反应，最终导致杀伤性T淋巴细胞激活，排斥反应发生。
本研究采用免疫组织化学染色的方法对外周血和角膜缘植片进行免疫学研究，检测CD25免疫分子在同种异体角膜缘移植免疫排斥反应中的表达状况，结果表明，移植术后排斥反应发生前，外周血和角膜缘植片CD25阳性T淋巴细胞极少，急性排斥反应发生时，角膜缘植片CD25阳性T淋巴细胞迅速增多，表明表达CD25的T淋巴细胞是免疫病理损害的基础。FK506组和环孢素A组的表达明显低于非治疗组，表明FK506和环孢素A延缓排斥反应发生的细胞学基础是减轻植片中T淋巴细胞的浸润和CD25分子的表达。FK506组的表达明显低于环孢素A组，表明FK506较环孢素A免疫抑制作用强。排斥反应发生后，角膜缘植片CD25的表达减弱，与外周血CD25的表达相对应，提示免疫反应可能进入下调状态。
本研究结果表明同种异体角膜缘移植术后早期应用0.5％FK506眼液可以抑制外周血、角膜缘植片T淋巴细胞上CD25的表达以及角膜缘植片淋巴细胞的浸润，从而抑制上皮排斥反应的发生，且抗排斥反应作用强于1％环孢素A眼液。本研究中尚未发现FK506局部滴用的副作用。FK506眼液必将成为治疗同种异体角膜缘移植术后免疫排斥反应的重要手段，具有良好的临床前景。本研究初步探讨了FK506对同种异体角膜缘移植术后早期免疫排斥反应的抑制作用，而对移植术后中、晚期免疫排斥反应的抑制作用尚有待进一步研究。
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