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小鼠视网膜缺血-再灌注后核因子-KB的激活

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2003-10-15 09:32:01

[摘要] 目的研究小鼠视网膜缺血-再灌注所致视网膜神经细胞凋亡中，核因子-KB的表达。方法通过升高小鼠眼内压造成视网膜缺血，用计算机图像分析方法测量视网膜再灌注后神经细胞凋亡的比例和视网膜厚度的改变。免疫组化标记核因子-KB p65亚单位，并与原位缺口末端标记(TUNEL)做双重荧光标记，分析核因子-KB的表达与细胞凋亡之间的时相关系。结果视网膜缺血-再灌注后最初24h，视网膜内层厚度增加，至168h，厚度显著减少。再灌注后6h，神经节细胞和内核细胞层中p65的免疫表达增强，至24h达到高峰，这一过程与TUNEL标记的时相一致。结论视网膜缺血-再灌注损伤后，核因子-KB的激活对于视网膜神经细胞的凋亡有重要作用，对于其起促进凋亡还是起抑制凋亡的作用，则有待于进一步研究。有报道认为，在神经细胞的缺血-再灌注过程中，反应性氧化物如超氧化物和过氧化氢的形成对细胞的损伤起着重要作用。视网膜短暂性缺血后的再灌注期间，有自由基和反应性氧化介质的形成。氧化抑制作用可通过一系列过程，包括脂质过氧化及形成过氧化亚硝酸盐而引发神经毒性反应。氧化抑制作用由许多细胞内信使分子介导，其中包括核因子-KB(nuclear factor-kapdaB，NF-KB)。有许多刺激因素如促细胞分裂素、细胞因子、紫外线等，可导致NF-KB激活。在大鼠和小鼠的视网膜缺血-再灌注损伤中，内核层和神经节细胞层均可产生神经细胞的凋亡。但是，尚未明确是否有NF-KB的参与。本研究的目的在于通过制作小鼠视网膜的缺血-再灌注模型，借助原位缺口末端标记(TUNEL)和免疫组织化学的方法，观察NF-KB在神经细胞凋亡中的激活。材料和方法 1、动物及手术方法：成年雄性C57BL／6J小鼠30只(由美国Jackson实验室提供)，鼠龄6-8周，体重18-26 g。通过提高眼内压造成视网膜缺血：腹膜下注射戊巴比妥钠(60 mg／kg体重)麻醉，脱品酰胺眼液散瞳2次，将带平衡盐液灌注管的30号针经右眼角膜周边刺人前房内，升高眼内压至120 mm Hg(1 mmHg：0．133 kPa)，维持60min后拔出针头。实验及术后复苏期间，用加热板使小鼠肛温保持在36-37℃。拔出针头后1、3、6、9、12、24、48、96及168 h断颈处死小鼠(每个时间点3只，另有3只作正常对照)。 2、标本处理及视网膜厚度测量：小鼠处死后即刻摘除眼球置入Tissue-Tek组织包埋剂中，在干冰盒内冷冻。组织块在-80℃冰箱内储存以备冰冻切片，全眼球从鼻侧至颞侧矢状冰冻连续切片，切片厚9mm，经视神经及其鼻侧和颞侧各30mm范围内切片放入切片盒内，-80℃冰箱内储存备用。常规HE染色，用Micro-PlanⅡ计算机图像分析系统(美国Laboratory Computer Systems．公司产品)在100倍放大倍率下测量视网膜内层(内界膜和外丛状层内面之间)厚度和外核层厚度。 3、TUNEL和计量分析：上述切片在空气中干燥后用新鲜的预冷丙酮固定，经3％H202，处理后在37℃下用末端dUTP转移酶和在TdT缓冲液中的生物素化的dUTP(美国Intergen公司产品)反应60 min，经抗地高辛反应、二氨基朕苯胺(DAB)显色。在400倍放大倍率下计数神经节细胞层和内核层中的TUNEL标记阳性细胞(每眼数3个切片，每个时间点数3只眼)，各层阳性细胞数与各层长度的比值为TUNEL标记阳性细胞指数。 4、免疫组织化学染色和计量分析：按VectorM．O．M．试剂盒手册(美国Vector Laboratories公司产品)进行上述冰冻切片的免疫组织化学染色(ABC法)。第一抗体为1：200鼠抗NF-KB，p65亚单位单克隆抗体(美国Chemicon公司产品)，第二抗体为生物素化的抗鼠IgG，DAB显色。统计神经节细胞层、内核层和外核层的阳性标记细胞数，除以各自的长度即为免疫标记细胞指数。 5、免疫组织化学、TUNEL双重标记：按前述方法行一抗、二抗反应后，用1：1 000 avidin-若丹明(美国VectorLaboratories公司产品)孵育30 min，在37℃下用末端dUTP转移酶和在TdT缓冲液中的生物素化的dUTP(美国Intergen公司产品)反应60 min，FITC抗地高辛反应，荧光显微镜下检查。结果 1、视网膜厚度、TUNEL标记和计量分析：再灌注早期，视网膜内核层厚度增加。再灌注后96h，内核层厚度开始变薄，至168h更为显著。在正常视网膜中，未发现TUNEL标记阳性细胞。再灌注后3及6h，分别在神经节细胞层、内核层及外核层开始出现TUNEL标记阳性细胞，24 h时达到高峰。168 h时神经节细胞层和内核层内仅有个别TUNEL标记阳性细胞。 2、免疫组织化学染色和计量分析：在正常视网膜中，神经节细胞层和内核层中仅有个别抗p65标记阳性细胞。从再灌注后1 h及6h开始，神经节细胞层、内核层和外核层中的抗p65标记阳性细胞数开始增加，信号开始增强至再灌注后24 h达到高峰，从再灌注后48h起，逐渐下降至168 h恢复到正常水平。 3、免疫组织化学、TUNEL双重标记：再灌注后神经节细胞层、内核层和外核层细胞中，p65免疫反应活性增强出现的时间稍早于TUNEL标记阳性细胞出现的时间，其后两者在各时间点上的高低走势基本一致。在活体动物实验中，视网膜缺血-再灌注模型曾被广泛用于诱导视网膜内层神经元细胞和神经胶质细胞的凋亡。本研究结果显示小鼠视网膜缺血再灌注模型中，神经节细胞、内核层细胞和感光细胞凋亡的动态变化过程。再灌注后3 h，用TUNEL标记的方法显示神经节细胞和内核层细胞开始出现凋亡，而外核层中的感光细胞则在再灌注后6 h才出现凋亡。神经节细胞层、内核层和外核层中的凋亡细胞数，都在再灌注后24 h达到高峰，这与在大鼠视网膜缺血-再灌注模型中所得的结果一致。在大鼠和小鼠的视网膜缺血-再灌注模型中，视网膜内层神经元损伤较外层更加明显，这可能不是因为视网膜内层和外层血流量阻断程度不一致所造成，因为在缺血模型中，已证实脉络膜血流和视网膜血流同时被阻断，而且对脉络膜血流的影响更为严重。此外，在其他的视网膜缺血模型如不影响眼内压而直接阻断血流的缝线结扎颈内动脉时，也有类似的现象。视网膜内外层神经元损伤程度的差异，可能与对神经传导递质、自由基、基因表达、或蛋白质合成的反应不同有关。 NF-KB是一种转录因子，由不同的蛋白亚单位构成，其中研究最多的是p50、p65(RelA)、RelB以及c-Rel。这些蛋白亚单位均有一个共同的区带(Rel同源区带)与DNA结合，同时形成二聚物。在未被激活的状态下，NF-KB位于细胞浆内与其抑制蛋白主要是IKB。和IxBp相结合。在细胞被激活时，NF-KB亚单位与其抑制蛋白分离，转位进入细胞核内与特异的xB DNA序列结合，然后激活不同的基因转录，合成功能蛋白如干扰素、细胞因子、细胞粘连分子等。因此，NF-xB调节许多在免疫、炎性反应及细胞凋亡中起重要作用的编码蛋白基因的表达，其激活可导致一氧化氮合成酶基因转录，从而可能在细胞缺血后损伤中产生作用。已证实NF-KB的激活参与了大脑神经细胞的缺血损伤过程，也有研究表明NF-KB的持续性激活可加重大脑的缺血性损伤，而这种作用可通过局部注射抗氧化剂LY231617而得到缓解。我们研究发现，视网膜缺血-再灌注后1-96 h，NF-KB在神经节细胞层、内核层中的细胞内呈高表达；而这一高表达在视网膜外核层中有相似的结果，只是时间稍有不同为6-96h。此外，视网膜缺血-再灌注所致的NF-KB激活，早于细胞凋亡现象的出现。随着时间推移，细胞凋亡程度的加重，NF-KB也随之表达增加，并逐渐从细胞浆内转位到细胞核中，至再灌注后24 h达到最高峰。这提示NF-KB在视网膜缺血-再灌注所致细胞凋亡过程中参与作用，NF-KB激活程度与细胞凋亡的程度有关。此外，个别炎性细胞中，也可能有NF-KB的激活。在某些研究中，证明NF-KB的激活可阻止神经细胞变性，然而，NF-KB的激活在细胞凋亡中是起促进作用还是起抑制作用则尚无最后定论，可能与损伤的原因和细胞的种类有关。最近的研究显示，大鼠视神经横向切断后，神经节细胞中的NF-KB被激活，并可阻止细胞凋亡。对于离体培养的视网膜感光细胞光损伤研究表明，NF-KB在未受损伤的细胞内持续高表达，损伤后表达水平随时间推移而逐渐降低。因此认为NF-KB对于防止氧化途径介导的感光细胞凋亡是必需的。本研究结果也证实正常小鼠视网膜内也有一定程的NF-KB表达，其他作者对于脑组织的研究也有类似发现，这提示NF-KB也参与调节神经细胞的正常生理功能。有报告认为，神经细胞膜上谷氨酸受体的激活是产生NF-KB持续活性的一个原因。目前对于视网膜缺血-再灌注所致的神经细胞凋亡的机制尚不完全清楚，对于NF-KB在由相同刺激引发的不同类型的神经细胞凋亡中是否具有相同的作用，也不完全清楚，这一些都有待于在今后的研究中做进一步阐述，而小鼠视网膜缺血-再灌注模型是在活体条件下研究这一课题的最佳模型。医疗器械商务网医疗信息医疗厂商医疗医械器械信息器械厂商器械
信息来源：陈跃国张成吴庭槐蒋健森曹安民


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