降落聚合酶链反应技术的应用_技术文章_信息分类

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降落聚合酶链反应技术的应用

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2003-09-28 16:31:28

[摘要] 目的建立降落(TOUCHDOWN)聚合酶链反应(PCR)方法，快速检测家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因点突变。方法设计LDL-R基因21对引物，根据TOUCHDOWN原理设计包括启动子和18个外显子特异性片段在内的PCR程序，通过试验选择PCR最佳反应条件，在同一程序中分别对21个片段进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，纯化后DNA产物测序分析该方法的特异性。结果编设退火温度范围从68℃降至54℃的PCR程序，优化PCR扩增条件，电泳检测采用同一程序同时分别扩增的LDL-R基因21个片段条带清晰，测序证实了此组片段的特异性。结论成功建立降落PCR方法，提示此法为LDL-R基因突变筛查提供了快速可靠的手段。家族性高胆固醇血症(化(atherosclerosis，AS)和早发冠心病的重要危险因素。在筛查LDL-R基因突变的研究中聚合酶链反应(PCR)技术被广泛应用。但由于突变位点不集中检测难度大，需要对LDL-R基因全部18个外显子及启动区21个片段进行扩增，若按常规PCR程序逐段扩增，工作量较大。本研究旨在建立一种采用相同反应条件和程序、不同引物，同时扩增21个片段的简便快速的降落(TOUCHDOWN)PCR方法。对象和方法一、对象临床诊断的家族性高胆固醇患者数名，临床诊断FH标准为：成人血清总胆固醇(TC)>7.8mmol／L；16岁以下儿童TC>6.7 mmol／L或成人低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)>4.4 mmol／L。收集患者空腹12h外周血标本3ml，EDTA-Na：抗凝，常规离心，分离血浆用于血脂测定，白细胞用于提取染色体DNA。二、主要仪器与试剂 TGLl6G台式高速离心机系上海医用分析仪器厂产品，Crony 630型半自动生化分析仪系意大利Crony公司产品，PROGENEⅡ型PCR扩增仪系英国TECHENE公司产品，DYY-Ⅲ型稳压电泳仪系北京六一仪器厂产品，紫外透射仪系上海天能有限公司产品。TC、TG、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定采用北京中生生物工程技术公司试剂Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、DNA Marker均为上海生物工程公司产品。三、实验方法 1、血脂测定：TC和TG测定采用酶法，HDL-C测定采用磷钨酸镁沉淀法，按试剂说明书进行操作。LDL-C采用Friedewald公式计算法，公式为：LDL-C；TC-HDL-C-TG／2.2(mmol／L)。 2、模板DNA提取：采用鄢盛恺等建立的改良碘化钠法提取基因组DNA[2]。紫外分光光度计测260nm和280nm波长吸光度(A)，以计算DNA模板的纯度和浓度。DNA浓度约在0.4-0.8ug／ul之间，DNA A260nm／A280nm。比值约在1.7～1.9之间。 3、PCR引物设计：采用生物学软件Primer 5.0并参考文献设计LDL-R基因涵盖全部18个外显子及启动子的引物。由于第4外显子、第10外显子因片段较大，不利于SSCP分析将其分为两段扩增，加上启动子共21对引物。 4、设计降落PCR程序：参考文献所建议的TOUCH DOWN引物设计原则(从高于融解温度(Tm)值15℃，每次降低1-20(2，最终降至低于Tm值5℃)并做适当修改见，对21对引物的Tm值进行预测，并根据全部退火温度值设定PCR循环程序中的温度变化范围，为照顾到21个片段，退火温度在最高69℃最低50℃的范围内，比较温度梯度以每降低1℃循环1次、每降低2~C循环2次和每降低3℃循环3次等一系列程序的扩增效果。 5、PCR反应体系：试验选择最佳PCR扩增条件，在确定PCR反应体系为25ul、10 ×buffer 2.5，ll，患者或正常对照DNA样品4 lll时，固定下列条件分别比较其中之一参数：Taq酶1 U、2 U和3 U，dNTPs．100umol／L、200umol／L和300umol／L，Mg2+1.5 mmol／L、2.5 mmol／L和3.75 mmol／L，上下游引物各3 pmol、6pmol和9 pmol，补足消毒双蒸水至25ul混匀后稍离心置于冰浴中，应用降落PCR程序扩增反应结束后即刻4℃贮存。 6、PCR产物鉴定：采用2％琼脂糖凝胶70 V电泳1 h，在紫外透射仪分别观察产物片断长度，并用带红色滤片的相机摄片。 7、核苷酸序列测定：PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收，纯化送交上海申友生物技术公司测定。结果 1、PCR反应的条件优化：经比较几种MgCl2、dNTPs、引物浓度和TagDNA聚合酶等参数，试验证实同时对21个片段扩增效果较好的反应体系为：2UTaq酶1 ×uffer，dNTPs 200 mol，Mg2+1．5 mmol／L，上下游引物各6pmol，总反应体系25ul。 2、退火温度范围选择：比较退火温度最高69℃，最低50℃的几套程序，选择可同时将21个片段扩增成功的程序，最后确定退火温度范围从68℃逐渐降至54℃的TOUCH DOWN PCR程序：(1)预变性：96~ 4 min。(2)PCR循环：95℃40 s，68℃1min，72℃45 s，循环1次；95℃40 s，65℃1min，72℃45 s，循环3次；95℃40 s，64℃1min，72℃45 s，循环3次；95~C40 s，63~C1 min，72吧45 s，循环3次；95~C40s，61℃1 min，72℃45 s，循环3次；9540s，60"C1 min，72℃45s，循环3次；95℃40s，58℃1 min，72℃45 s，循环3次；95℃40 s，57℃1 min，72℃45 s，循环3次；95℃40 s，56吧1min，72℃45 s，循环3次；95吧40 s，54~C1 rain，72~E45 s，循环15次，共40次。(3)延伸：72~C10min，结束反应。 3、PCR扩增LDL-R基因21个片段结果：采用相同的反应组成和循环参数采用不同引物，一次即可有效地扩增21个片段(分别21管)，产物鉴定采用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增出的特异性条带与目的片段大小一致。 4、扩增产物的特异性检测：LDL-R基因21个片段分别测序，并与Genebank对照，证实了此组片段特异性良好。讨论研究LDL-R基因突变的方法主要有Southem杂交和采用PCR技术对整个LDL-R基因进行扩增的方法，如单链构象多态性(single strandconformationpolymorphism，SSCP)。与核酸杂交技术相比PCR具有简便、高效的特点，可检测出多种类型的突变(如碱基置换、点突变、微缺失或插入等)。国内外大量文献[4.6]采用PCR-SSCP筛查LDL-R基因，已发现大量突变，经检索目前最大的FH突变数据库的761种突变，其突变位点分散遍及整个基因。目前对FH患者筛查时，通常需要采用不同程序，逐一对LDL-R基因的启动区和全部18个外显子进行扩增，但尚未见快速、简便扩增LDL-R基因方法的报道。 1991年Don等报道降落PCR，代表一种完全不同的优化方法，与普通PCR操作基本一样，只是编设一系列退火温度从较高温度开始逐步降低的循环反应程序，一组反应管分别加入不同引物，可同时扩增出不同特异性靶基因序列片段，并获得理想的扩增效果。该方法的基本原理是在设定程序时选择退火温度高于计算的Tm值15℃，随着循环的进行逐步降至Tm值，最终低于Tm值5℃。这一策略司保障第一个引物与模板杂交发生在最互补的反应物(目的扩增片段)之间，任何不同的变性温度与不同的复性温度之间循环，能得到2倍增高的正确或不正确的产物，在随后的退火温度继续下降的过程中，上述的延伸合成会继续进行。此后Hecker等应用并改进了上述技术。国内此项技术应用较少，仅见个别报道。万兵等[8]在构建人CDl37-hlgGlFc-pCDNA3融合蛋白真核表达载体过程中运用降落PCR扩增目的基因；唐恩洁等采用降落PCR技术从人肝细胞cDNA文库中扩增Fas基因；况少青等将此技术结合多重PCR同时扩增微卫星DNA；均取得较好的效果。本研究根据TOUCHDOWN原理，设计LDL-R基因涵盖每个外显子的引物，并对21对引物的Tm值进行预测，由于退火温度是试验成败的关键，本研究根据计算退火温度值设定PCR循环程序中的温度变化范围，通过实验确定最佳反应条件。同时对PCR反应体系中Mg2+、dNTP和Tag聚合酶等其他可变参数进行逐项优化，目前我们可一次性有效扩增同一FH患者LDL-R基因的21个特异性片段。本试验结果表明，成功建立降落PCR的方法，仅需应用一套温度程序扩增，既可对FH患者LDL-R基因启动子区和全部18个外显子进行检测，并能在1 d内完成，目前国内外尚未见此法应用于LDL-R基因检测的报道。本方法的建立为LDL-R基因的PCR-SSCP分析提供了快速可靠的方法，进而为家族性高胆固醇人群LDL-R基因突变的筛查提供有效手段，有广阔的应用前景。医疗器械商务网医疗信息医疗厂商医疗医械器械信息器械厂商器械
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