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MDM2蛋白对卵巢癌细胞药物敏感性的影响
hc360慧聪网医疗器械行业频道 2003-09-26 14:31:42
    卵巢癌在进行化学药物治疗(化疗)中的耐药问题十分棘手。目前，关于p53-MDM2蛋白对癌细胞对顺铂类化疗药物敏感性(药敏性)影响的研究日渐深入，MDM2蛋白是p53的调节因子，是一种细胞原癌蛋白，其过度表达时，可阻断p53的功能。为了解MDM2蛋白在卵巢癌细胞中的表达及对卵巢癌细胞耐药性的影响，我们选取p53野生型的人类卵巢癌细系A2780，转染MDM2基因，并使MDM2过度表达，观察卵巢癌细胞药敏性的改变，并通过观察细胞周期的改变以及核酸切除修复情况，旨在从体外实验证实MDM2蛋白对增强卵巢癌细胞对顺铂类药物敏感性的作用。

    一、材料与方法
    1、材料来源：人卵巢癌细胞系A2780由德国RobeaZ教授惠赠。PCMV-MDM2质粒由以色列Moshe O教授惠赠。宿主菌DH5a由中国医学科学院血液学研究所提供；脂质体、MDM2单克隆抗体，二抗及显色系统购自美国生命科学技术公司；氯霉素乙酰转移酶酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自美国Gibico公司。
    2、质粒DNA及空载体制备、基因转染及阳性克隆筛选：(1)质粒DNA及空载体制备：参照《分子克隆指南》(第2 版)。(2)取纯化质粒pCMV-MDM2及pCMV(空载体，作为空白对照)各2ug，经脂质体包裹后，转染A2780卵巢癌细胞系，3 d后加入G418(500ug／m1)筛选，14 d后获抗G418阳性克隆，选取独立生长良好的克隆于24孔板中继续扩增培养，分别命名为A2780-M和A2780-V。
    3、Western印迹法检测转染前后细胞的MDM2蛋白表达：A2780-V和A2780-M经细胞裂解及对细胞抽提液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析后，各取50ug蛋白样品行电转移。
    4、转染前后细胞药敏性变化检测：分别将单细胞悬液接种于96孔板，每组6个重复孔。24h后，分别加入药物浓度为40、20、10、5、2.5、0 umol的顺铂，72h后，应用四甲基偶氮唑蓝(MTr)比色法，测定细胞存活率[波长570nm时吸光度(A)值]。细胞存活率二(A实验孔A对照组)×100％
    5、转染前后细胞周期的改变：将细胞在含25umol顺铂培养基中孵育2 h，换为正常培养基继续培养24 h。取106个细胞，70％乙醇固定，50ug／mlRNA酶消化，10ug／ml碘化丙锭(PI)4~C避光染色30min后进行检测。
    6、宿主细胞重激活实验：将携带有氯霉素乙酰转移酶(CAT)的pCAT~3质粒溶于含200 1mmol顺铂的1 mmolTris-HCl(pH 7.8)，10 mmo]NaCl，1 mmol乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中，使质粒受到顺铂破坏。将5ug此质粒脂质体转染于细胞中，72h后按照ELISA试剂盒说明书，定量测定CAT表达。
    7、统计学方法：SPSS统计软件分析，行回归分析、方差分析及3个样本两两比较的检验。

    二、结果
  1、 基因转染后的MDM2蛋白表达及药敏性变化：转染后MDM2蛋白表达提高2-3倍，对顺铂的药敏性以MTr染色结果比较，A2780的IC5o为(13.5±1.5)umol，与A2780-V比较，差异无显著性。A2780-V的IC50为(15.1±1.4)ixmol；A2780-M的IC50为(8.0±1.3)umol；两者比较，差异有极显著性(p<0.001)。
    2、顺铂对转染前后肿瘤细胞周期的影响：3组的细胞周期在未与顺铂作用前无明显区别(G1期为67.3-75.3，S期为20.9-30.2，G2／M期为2.5-4.3)。与顺铂作用后，A2780、A2780-V的C2期细胞百分比均明显升高(52.7％)，而A2780-M的S期细胞百分比明显升高(80.0％)。
    3、细胞对顺铂导致的DNA损伤的修复能力变化：A2780的CAT活性为(0.33±0.09)ng／100ug，A2780-M的CAT活性为(0.21土0.07)ng／100ug，与A2780比较，A2780-M细胞对顺铂导致的DNA损伤的修复能力下降。

    三、讨论
    顺铂是治疗卵巢癌的主要化疗药物。其杀伤肿瘤细胞的作用，是通过使DNA链内和双链之间的缠绕变形导致DNA损伤而实现的，这种损伤主要由p53介导的核苷酸切除反应(nucleotide excisionrepair，NER)修复。在主要编码细胞周期阻滞，并在此过程中进行核酸切除修复反应的细胞类型中，由于铂类药物所致的DNA变形损伤被切除，细胞对铂类药物敏感性减低；阻断这种反应，则会增加其药敏性。本研究结果显示，A2780-M在DNA未受损伤时，同A2780的细胞周期变化没有明显的不同。然而，A2780-M在与顺铂作用后，细胞G1期明显缩短，而S期明显延长，显示出G1阻滞能力下降，允许细胞进入S期而进行受损DNA的累积，导致不成功的减数分裂和细胞死亡，使A2780-M的药敏性增加。A2780在与顺铂作用后，出现了明显的G2期阻滞，这使出现DNA损伤的细胞在进入关键的染色体分裂过程前修复，因而降低了顺铂对A2780细胞的杀伤作用。

    我们利用宿主细胞重激活实验，直接测试转染MDM2的细胞，DNA修复能力的改变。由于顺铂导致的DNA损伤，可显著阻滞RNA多聚酶Ⅱ的转录过程，因此，编码了CAT的质粒受损伤后，在转染至DNA修复缺陷的细胞时，则不表达其携带的基因。因而受损伤质粒的重激活便成为衡量某一特定细胞系DNA修复能力的指标。在本研究中，我们用顺铂损伤的pCAT-3质粒，来衡量细胞对顺铂导致的DNA损伤的修复能力，结果显示，MDM2阻滞了顺铂导致的基因修复，其核苷酸切除修复能力下降，因而药敏性增加。

    目前，许多化疗药物都是DNA损伤制剂，如能将改变癌细胞周期和DNA修复能力作为化疗药物的主要作用点，将可更大程度地杀灭肿瘤细胞。
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信息来源： 倪虹 糜若然
 
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