过量摄人氟后激活的成骨flit胞系中原癌基因的表达_技术文章_信息分类

当前位置：首页 > 信息分类 > 技术文章 > 正文

过量摄人氟后激活的成骨flit胞系中原癌基因的表达

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2003-09-15 11:31:41

[摘要] 目的研究在体内外过量氟作用下激活的成骨细胞系中原癌基因c-fas和其伴随基因c-jun的表达。方法在饮水中加入氟化钠(NaF)进行大鼠染毒实验，在体外成骨样细胞培养液中加入氟化钠进行染氟实验，采用原位杂交技术、Western印迹技术和免疫组织化学方法对氟中毒大鼠骨组织进行c-fas、c-jun的mRNA水平、蛋白质水平的定量分析和成骨样细胞染氟后不同时间c-fos、c-junmRNA的定量分析。结果 NaF可刺激慢性氟中毒大鼠椎骨各包被成骨细胞增殖，并诱导c-fas、c-jun的表达。高钙加氟组c-fas、c-jun mRNA表达的吸光度值分别为107.74和117.48，明显低于高钙对照组的139.63和126.37。免疫组化分析结果显示，高钙加氟组c-fos、c-jun蛋白水平(吸光度值分别为140.73和134.03)明显低于高钙对照组，低钙加氟组c-fos、c-jun mRNA和蛋白表达(吸光度值分别为117.24、111.46、132.46和129.79)明显低于低钙对照组(吸光度值分别139.16、131.15、149.98和149.19)，差异有显著性。Western印迹技术检测NaF各组骨外膜成骨细胞系细胞c-fas、c-jun的蛋白水平明显低于各自的对照组，吸光度值分别为123.32、116.60、115.97和108.30。成骨样细胞染氟12 h，c-los、c-jun mRNA含量明显增高，48 h仍不见减少，其吸光度值分别为114.80、161.14、118.20和150.41，与对照组比较差异非常显著。结论过量氟可以刺激大鼠成骨细胞系和培养的成骨样细胞激活，增殖能力增强，c-fas、c-jun在mRNA和蛋白质水平的表达增强，c-fas过表达在氟骨症骨相损害的发生发展中可能起重要的作用。氟化物通过促进成骨细胞系DNA合成增加，直接刺激成骨细胞系细胞增殖、增强碱性磷酸酶含量和活性，使骨钙素(ostelcalcin)增高、胶原合成增加而发挥对骨的特征性作用，其对成骨细胞的促增殖作用的分子调控机制尚不十分清楚。新近的研究结果揭示，原癌基因c-fos、c-jun组成的转录活化因子AP-1与成骨细胞活化密切相关1，25-二羟维生素D3、转化生长因子-B(TGF-p)通过与成骨细胞基因组的协同作用诱导鼠成骨细胞AP-1活化，甲状旁腺激素(PTH)、前列腺素(PG)、胰岛素样生长因子(1GF)、TGF-p等均能调节c-fos和其他早期反应基因的表达，影响成骨细胞的增殖和分化。我们采用饮水加氟进行大鼠染毒和成骨样细胞染氟实验，观察不同饲养条件、不同浓度氟化钠(NaF)对大鼠成骨细胞系细胞和成骨样细胞染氟后的增殖及c-fos、c-jun的mRNA和蛋白质表达水平的影响。初步探讨了参与慢性氟中毒的骨相损害调节的相关基因的激活和表达。材料与方法 1、大鼠饮水加入NaF染毒实验： (1)动物分组与处理：实验动物系白求恩医科大学实验动物部提供的封闭群动物Wistar大鼠72只，雌雄各半，体重约120g，随机分为高钙和低钙两大组。高钙组又分为高钙加氟组(高钙饲料加饮水F-100mg／L)和高钙对照组(仅用高钙饲料)，每组24只；低钙组又分为低钙加氟组(低钙饲料加饮水F-50 mg／L)和低钙对照组(仅用低钙饲料)，每组12只。高钙组用白求恩医科大学实验动物部提供的富钙平衡饲料喂养，饲料成分：玉米面占48.0％，黄豆面占20.0％，麸子面占15.0％，高粱面占7.0％，鱼粉占5.0％，骨粉占2.3％、食盐占0.5％，其含钙量为0.79％；低钙组用自制低钙饲料喂养，饲料成分：玉米面占89％、豆面占10％、食盐占1％，含钙量为0．063％。饮水采用长春市自来水，其含氟量忽略不计；含氟水的配制：50mgF-／L水(每升水投分析纯氟化钠110.5mg)，100 mgF-／L组(每升水投分析纯NaF 221.0mg)。实验期间动物自由摄食、进水，实验周期20周。 (2)试剂：c-fos、c-jun的mRNA探针购自博士德生物工程公司，免疫组化、蛋白印迹应用兔抗大鼠多克隆抗体购自Santa Cruz Bitechnology公司。 (3)检测指标及方法：取慢性氟中毒大鼠脊椎骨4％多聚甲醛固定，薄切3-4um。HE染色、原位杂交法，用磷酸盐缓冲液(PBS)替代mRNA探针杂交液作为阴性对照，检测成骨活动的骨内膜包被、皮质骨内包被(哈佛管包被)和骨小梁包被的成骨细胞系c-fos、c-jun mRNA水平，应用地高辛标记寡核苷酸探针，原位杂交采用链霉亲和素-过氧化物酶复合物法，二氨基联苯胺(DAB)法显色；同时应用免疫组织化学法(CSA法)，用PBS替代一抗作为阴性对照，DAB法显色，检测c-fos、c-jun蛋白质表达；取液氮快速冷冻、-80~C保存的骨外膜包被组织，采用改良Westernblot法[7]检测c-fos、c-jun蛋白质表达。应用图像分析仪(HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统)对全部实验结果进行吸光度值检测及定量分析。全部实验数据采用SPSS统计软件进行方差分析和g检验。 2、成骨样细胞(osteoblast-likecell)培养染氟实验：复苏成骨样细胞，用5％FCS-IMDM培养基于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。待细胞生长良好，用0.25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，以2×104／cm2的密度接种于已置入消毒盖玻片的6孔培养板中培养，设置不同染氟时间、浓度。染氟细胞按原位杂交要求，以4％多聚甲醛-PBS固定细胞30min，0.1 moL／LPBS洗涤、晾干后-40℃保存备用。结果 1、成骨细胞系激活、增殖活跃：本实验中侧重观察大鼠腰椎的改变。椎骨在解剖学上属于不规则骨，即软骨内成骨的骨骼。加氟后大鼠骨病变为以成骨功能活跃为主的骨转换加速，伴破骨性骨吸收增强改变，且以低钙加氟组病变比较明显。主要表现为： (1)骨外膜内层(即骨外膜包被)细胞增生活跃，细胞层数增多；有的部位骨小梁表面可见成骨细胞胞体肥大。 (2)在连续骨板的表面以及骨小梁表面，有些部位可见薄层淡染的骨样组织。 (3)部分大鼠贴近骨小梁可见薄层纤维组织，即骨小梁周围纤维化。以上所见属于以成骨功能活跃为主的骨转换加速改变，但在程度上比长骨轻。同一组动物长骨(胫骨)可见破骨细胞增多、骨吸收增强和骨干部密质骨松质化，而在脊椎骨则表现很轻微。在脊椎仅见骨小梁周围纤维化，而在长骨则骨髓纤维化很明显。与低钙加氟组相比，高钙加氟组病变显著减轻，除骨外膜内层细胞增生外，其他与对照组比较差异无显著性。少数动物可见软骨生长板下方骨小梁较密，骨小梁间连接较多。 2、体外培养成骨细胞：染氟各组细胞增殖速度加快，染氟12h组细胞密度大于正常对照组，细胞片HE染色见细胞核明显深染。染氟48h组细胞生长速度未见减慢，由于细胞密度增大而呈现密集的梭形。细胞黏附性加大，培养瓶内细胞同样用胰蛋白酶消化，与对照组相比，消化时间增加约1倍。 3、过量氟作用对成骨细胞c-fos、c-jun的表达的影响：在氟中毒大鼠脊椎骨成骨细胞中c-los和c-jun mRNA水平明显升高。高钙加氟组与对照组比较和低钙加氟组与对照组比较，代表c-fos和c-jun的mRNA信号在细胞质内呈强阳性覆盖胞核(-9)，吸光度值(测定值为光透过度值，故光密度越大，吸光度值越低)显著降低。氟中毒组大鼠c-fos、c-jun蛋白阳性细胞均为胞体肥大，多呈不规则的方形或长椭圆形，或附着于骨表面的长梭型；检测等效直径均大于阴性细胞；而对照组的阳性成骨细胞胞体均小于加氟组阳性细胞，其阳性细胞测定面积均小于加氟组成骨细胞面积；加氟组阳性细胞数和阳性颗粒吸光度值与对照组比较显著降低相关分析结果显示，在脊椎骨成骨细胞中c-fos和c-jun mRNA表达水平为正相关(r=0.703，p<0.01)，表明氟化物在激活c-fos基因的同时也伴随c-jun基因的激活。伴随c-fos和c-jun的mRNA表达增强，其蛋白质水平也增高。原位杂交检测c-fos、c-jun的mRNA与免疫组化检测的蛋白质吸光度定量分析结果表明，在脊椎骨成骨细胞中，c-jun的mRNA与蛋白质表达呈正相关(r=0.85，p<0.01)；c-fos的mRNA与蛋白质有正相关趋势，但差异无显著性(p>0.05)。采用改良Western印迹技术，应用兔抗大鼠c-fos多克隆抗体和c-jun多克隆抗体对骨外膜组织蛋白进行检测，检测到c-fos(62 000)和c-jun(39000)蛋白的阳性杂交带。氟中毒大鼠骨外膜中c-fos和c-jun基因产物明显增多。 4、成骨样细胞染氟后c-fos、c-jun的mRNA表达：加氟1和2m旷L组细胞c-fos、c-jun的mRNA表达差别不大。在加氟12h后c-fos的mRNA明显增加，染氟各组成骨样细胞c-los的mRNA均明显增加，且c-fos的mRNA信号强度不因时间延长而明显下降，表明氟化物确实具有激活成骨细胞中c-los基因，并且延长其表达时限的作用。c-jun的mRNA在加氟48h组增加更为明显。讨论慢性氟中毒的骨骼病变复杂多样，成骨细胞功能活跃是一个发生较早并起主导作用的环节。氟增加骨形成是通过促进成骨细胞增殖、增加类骨质沉积而实现的。氟在不同种属动物和人类有促进成骨细胞有丝分裂的作用。本研究结果显示，氟中毒状态下成骨细胞处于激活状态。在慢性氟中毒大鼠脊椎的各包被中，均可见成骨细胞系的增殖活跃和成骨细胞的胞体肥大、排列密集，表明在过量氟的作用下成骨细胞激活是慢性氟中毒氟骨症发生的重要原因。从地方性氟中毒病的流行病学来看，无论国内外，重症、致残性的氟骨症总是与营养不良，特别是膳食明显缺钙密切相关。实验病理学结果证明，膳食低钙可加重氟中毒的骨、牙损害，在低钙饲料条件下，大鼠对氟中毒的抵抗力显著降低。在本实验结果中，伴随低钙而加重的骨相损害的骨组织成骨细胞系c-fos、c-jun的mRNA、蛋白质水平呈持续高表达，提示膳食低钙是氟骨症发生的一个重要因素，也可能低钙本身诱导了c-fos、c-jun基因激活，但在成骨样细胞染氟实验中，在培养液相同钙离子水平情况下，染氟组c-fos、c-jun的mRNA水平呈持续增高，进而表明过量F-在激活成骨细胞系的同时即诱导c-fos、c-jun基因激活。早期快速表达基因c-fos的mRNA在成骨样细跑染氟12h即达到高峰，而在染氟20周大鼠成骨细胞中检测到c-fos和c-jun基因mRNA及其基因产物的过表达，不论在高钙染毒还是在低钙染毒情况下，成骨细胞系c-fos和c-jun基因及其产物过表达与对照组相比有非常显著性意义。且c-fos与c-jun的mRNA表达呈正相关。其中，c-jun的mRNA与其基因产物呈正相关，表明氟化物不仅在mRNA水平，也在蛋白质水平刺激c-los和c-jun基因的表达，看来F-可能作为一种丝裂原刺激成骨细胞持续表达c-fos。氟骨症的破骨性吸收增强和骨小梁周围纤维化等均表明PTH分泌增多。c-fos参与PTH／PTH相关肽引起的成骨细胞增殖[11]，而且c-fos的mRNA增强表达是PTH在体内活化骨合成代谢的中间信号调节的基础[12]，故本研究结果中c-fos过表达可与PTH增高联系起来。在小鼠转人人金属硫蛋白启动子后，骨骼出现破骨性骨吸收与成骨活动均有加强，干骺端膨大、骨髓纤维化，原有的板层骨与新形成的编织骨并存，形成特征性的镶嵌状态[13]。这些由c-fos基因过表达引起的骨病变与氟骨症的骨相改变颇为相近。本研究结果中骨相损害与c-fos基因过表达所致的骨病变基本一致，提示在慢性氟中毒的晚期有c-fos基因持续表达，可能c-fos参与了成骨细胞激活，并与氟骨症的整个病理过程有关。但也不能排除氟骨症对c-fos基因的反相诱导所致的c-fos过表达。我们还观察到，染氟12 h后c-fos的mRNA即达到很高的水平，且持续至48h仍不见减弱，提示F-可诱导成骨细胞系c-fos的mRNA的快速、持续表达，这一表现可能与氟骨症晚期仍有c-fosmRNA的表达机制相同。综上所述，我们有理由认为c-fos基因过表达是慢性氟中毒时在转录调控水平上至关重要的发病环节。c-fos基因过表达可能同时伴有成骨细胞增殖调节的信号系统及其他转录调节基因的参与，c-fos作为下游靶基因，可能通过各种不同的信号传导途径影响骨代谢。本研究结果对进一步探讨氟化物促进成骨细胞增殖的分子调节机制和氟骨症发生的基因调节研究提供了实验依据。
信息来源：张文岚崔亚南高中张秀云李广生


【查看相关评论】【推荐给朋友】【关闭窗口】