大肠重复癌MMR、p53、Bax、PCNA表达及微卫星不稳定性研究_泌尿外科_医学文库_信息分类_hc360慧聪网医疗器械行业频道

当前位置：首页 > 信息分类 > 医学文库 > 泌尿外科 > 正文

大肠重复癌MMR、p53、Bax、PCNA表达及微卫星不稳定性研究

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-04-20 14:54:58

[摘要] 目的探讨微卫星不稳定性(MSI)在大肠重复癌与单发癌中的变化规律，及MMR、p53、Bax、PCNA表达与MSI的关系。方法采用免疫组化、PCR-SSLP法对38例大肠重复癌患者的51处癌灶及35例单发大肠癌分别进行MMR，p53，Bax、PCNA表达的检测和5个微卫星位点MSI检测。结果重复癌组复制错误阳性率为53％(27／51)，单发癌组为17％(6／35)，差异有显著性意义(x²=11.25，P<0.01)。重复癌组中，RER+与MMR表达缺失有密切的相关性；RER+与p53表达呈负相关；RER+组PCNA标记指数显著低于RER-组；RER+与低分化、近端大肠癌密切相关。结论MSI在大肠重复癌的发生上起着重要作用，MSI可作为预测大肠重复癌发生的重要标志。 [关键词] 结肠直肠肿瘤；重复癌；基因表达；微卫星不稳定性重复癌是指同一器官或多个器官、组织同时或先后发生的两种或两种以上的恶性肿瘤。大肠重复癌包括肠道内多原发大肠癌和肠道外重复癌。最近研究发现，遗传性非息肉病性大肠癌和部分散发性大肠癌的发生是错配修复(mismatch repair，MMR)基因突变引起的微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)所致^[1]。MSI是指由复制错误(replication errors，RER)引起的简单重复序列的增加或丢失，被认为是大肠癌发生的新机制。本项研究就p53，PCNA，Bax与MSI的关系进行探讨。材料与方法一、一般资料按照Warren提出的重复癌诊断标准，即(1)各种肿瘤必须均为恶性；(2)各种肿瘤必须发生于不同部位，每个肿瘤有其独特的病理形态；(3)应除外转移和复发的可能。收集1980-2001年于我院手术切除的38例大肠重复癌的肿瘤及正常组织切缘存档蜡块，包括16例肠道内多原发大肠癌及22例肠道外重复癌，共5l处癌灶；以结肠脾曲为界，近端大肠癌16例，远端35例；高、中分化腺癌38例，低分化、粘液腺癌13例。随机选取同期35例单发大肠癌作对照。二、免疫组化检测连续切片厚4 μm，分别行HE染色及MMR(hMSH2及hMLHl)、p53、Bax、PCNA表达的SP法免疫组化检测。试剂均购自北京中山生物技术有限公司。切片经微波炉抗原修复，按试剂盒说明书进行。每组用已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。两人双盲法观察结果，p53阳性反应为核染成棕黄色颗粒，PCNA染色采用计数标记指数(1abelingindex，LI)，Bax为胞浆及核膜呈黄褐色均匀颗粒状着色，其着色细胞超过切片中肿瘤细胞的10％时计为阳性。hMSH2及hMLHl阳性者表现为细胞浆和(或)细胞核呈棕黄色着色。三、MSI检测 (1)DNA提取：参照文献^[2]分别提取癌组织及相应正常组织DNA。(2)寡核苷酸引物^[3]：BAT-25，BAT-26，D5S346(APC)，D2S123，D17S250由上海Sangon公司合成。(3)聚合酶链反应-简单序列长度多态性分析<polymerase chain reaction-simple sequence length polymorphism，PCR-SSLP)：所用试剂均购自上海Sangon公司。25μl反应体系中包括10×缓冲液2.5μl，4种dNTP混合物终浓度100μmoL／L，MgC₁₂终浓度2.0mmol／L，引物终浓度0.4μmoL／L，Taq酶1.5U，模板DNA约100ng。94℃ 3min，94℃45s，57℃ 1 min，72℃ 1min，35个循环，72℃ 5min。取5μl PCR产物+5 μl变性缓冲液(98％甲酰胺，2％EDTA0.5mol／LpH 8.0，0.025％溴酚蓝)，97℃变性10min，40％乙醇碎冰冰浴5min，加样于8％变性聚丙烯酰胺凝胶(19：l，含7mol／L尿素)，500V恒压电泳2.5-4h。(4)硝酸银染色。每例标本中，肿瘤组织与相应的正常组织相比，出现DNA等位片段的增多、减少或移位，即为MSI阳性。≥2个位点出现MSI则界定为RER+。四、统计学分析采用t检验及X²检验。结果一、各免疫组化指标表达情况 (1)重复癌组癌灶中2l例hMLHl表达阴性，6例hMSH2表达阴性，其中3例二者皆阴性，MMR表达阴性率为47％(24／51)；对照组中5例hMLHl表达阴性，1例hMSH2表达阴性，MMR表达阴性率为17％(6／35)，X2**=8.18，P<0.01，差异有非常显著意义。(2)重复癌组p53表达阳性率为39％(20／51)，对照组为43％(15／35)，X²=0.12，P>0.05，差异无显著性意义。(3)重复癌组PCNA标记指数51％±17％与对照组54％±26％相比，t=0.62，P>0.05，差异无显著性意义。(4)重复癌组Bax表达阳性率为67％(34／51)，对照组为77％(27／35)，X²=1.10，P>0.05，差异无显著性意义。二、MSI检出阳性率比较 (1)重复癌组RER阳性率为53％(27／51)，对照组为17％(6／35)X²=11.25，P<0.01，差异有显著性意义。(2)肠外重复癌RER阳性率为46％(10／22)，肠内多发癌患者29处癌灶RER阳性率为59％(17／29)，X²=0.87，P>0.05，差异无显著性意义。三、大肠重复癌RER与MMR、p53、Bax、PCNA表达的关系重复癌组中，24例MMR表达阴性的癌灶皆为RER阳性，两者有良好的相关性；RER阳性组p53阳性表达率显著低于RER阴性组；RER阳性组PCNA标记指数显著低于RER阴性组；Bax表达两组差异无显著性意义。四、大肠重复癌临床综合因素与RER的关系低分化、粘液腺癌RER阳性率高于高、中分化腺癌；近端大肠癌RER阳性率显著高于远端大肠。年龄、性别、是否伴有转移、Dukes分期RER阳性组与阴性组差异无显著性意义。讨论错配修复基因是广泛存在于原核及真核生物内高度保守的看家基因。MMR功能缺陷与多种肿瘤尤其是大肠癌的发生密切相关。MMR缺陷细胞修复错配碱基的功能降低或缺失，导致MSI形成，产生与MSI相关的基因组不稳定性，患者肿瘤易感性增加。本次实验重复癌组RER阳性率为53％(27／51)，与单发癌17％(6／35)比较，差异非常显著。提示MSI在大肠重复癌的发生、发展中起着重要作用。Sengupta等^[4]对15例大肠肠内重复癌的24处癌灶进行MSI检测，阳性率为70.8％(17／24)；而对照组14例大肠单发癌中仅有1例MSI阳性。Masubuchi等^[5]对19例异时大肠肠内重复癌患者MSI检测的结果也同样显示，重复癌组MSI阳性率89％(17／19)明显高于对照组14％(4／28)。国内关于重复癌的报道多集中在病例报告，病理特点分析仅张立力等^[6]对24例多原发大肠癌进行MSI检测，发现多原发大肠癌MSI的发生率为71％(17／24)，而单发癌为38％(8／21)，两者有明显差异。Deng 等^[7]对7l例散发性大肠癌MSI检测中发现23.9％(17／71)呈现MSI阳性，在MSI阳性病例中，有12例MMR表达阴性(hMLHl表达阴性9例，hMSH2表达阴性3例)。本组的实验结果显示，MSI与MMR表达缺失有良好的相关性，可见MMR基因功能丧失在MSI发生中起着重要作用。由于用免疫组化检测到的p53为突变型，重复癌组显示RER阳性与p53表达呈负相关，说明RER阳性大肠癌的发生与p53突变关系不大。RER阳性病例PCNA LI低，提示RER阳性病例较RER阴性病例增殖活性低。Umar等^[8]研究发现，PCNA在MSH2、MLHl错配修复过程中为必须蛋白，PCNA参与的错配修复过程先于DNA的再合成。PCNA的减少可引起错配修复功能降低或缺乏，从而增加了MSI发生的可能。本次试验显示近端大肠癌RER阳性率明显高于远端大肠，其他学者也有类似报道^[9，10]，提示远近端大肠癌的发生在基因水平是不同的，即近端大肠癌的发生主要是通过RER途径引起肿瘤相关基因的突变而引起肿瘤，而远端大肠癌的发生主要通过癌基因、抑癌基因的突变导致肿瘤，说明MSI主要参与了近端大肠癌的发生过程。我们的研究结果提示MSI大肠重复癌的发生上起着重要作用，MSI可作为预测大肠重复癌发生的重要标志，对MSI存在的大肠癌患者应警惕多重癌发生的可能。今后我们要在MSI的分子测序、MSI目标基因的研究上进一步探讨。hc360慧聪网医疗器械行业频道慧聪医疗器械医疗器械医疗设备 CT B超
信息来源：任延律张岂凡于志伟等


【查看相关评论】【推荐给朋友】【关闭窗口】