[摘要] 目的 研究50Hz工频磁场对细胞膜表皮生长因子(ECP)和肿瘤坏死因子(TNF)受体聚簇的可能诱导作用，进一步说明工频磁场生物效应细胞信号起始部位及噪声磁场可能存在的干预作用。方法 将中国仓鼠肺成纤维细胞分别用EGF、TNF、0.4mT的工频磁场、噪声磁场或工频磁场与噪声磁场叠加的复合磁场处理一定时间后，以免疫组化方法标记细胞膜EGF及TNF受体，并用激光共聚焦显微镜观察分析细胞膜EGF及TNF受体的聚簇程度。结果 细胞经EGF及TNF处理5min后即可诱导相应受体的聚簇，0.4mT工频磁场辐照5 min后也可诱导细胞膜EGF及TNF受体的聚簇，并均在15min时达到最大程度。然而相同强度的噪声磁场不能诱导细胞膜受体的聚簇。当等强度的噪声磁场与工频磁场叠加后，可以抑制工频磁场诱导的细胞膜EGF及TNF受体聚簇。结论50Hz工频磁场与相应配体一样，能诱导细胞膜EGF及TNF受体的聚簇，膜受体是电磁场可能的信号耦合位点之一。等强度的噪声磁场可干预工频磁场对细胞膜受体聚簇的诱导。
[关键词] 电磁场；受体，表皮生长因子；受体，肿瘤坏死因子；噪声
电力事业的飞速发展使得环境空间的极低频磁场(extremely LOW frequency magnetic field，ELFMF，50Hz)强度快速增长。EIFMF可产生许多生物学效应，如暴露于高压输电线等产生的ELPMF，可增加白血病、神经系统肿瘤、淋巴瘤及乳腺癌的发病率[1-5]。KLFMF如何激活细胞内信号途径，尤其是磁场由物理信号转化成为生物信号的耦合位点尚不明确。我们研究工频磁场对细胞膜受体聚簇的影响，旨在探索ELFMF信号转导过程中的信号耦合位点及噪声磁场对受体聚簇可能存在的干预作用。材料与方法
1．主要试剂与仪器：表皮生长因子(EGF)和肿瘤坏死因子(TNF-α，美国Calbiochem公司)，抗-EGF受体和抗-TNF-受体1(美国SantaCruz公司)，乙基苯基聚乙二醇(NP40，美国Fluka公司)，丙基碘(美国Sigma公司)，RPMl 1640培养液(美国Gibco公司)，山羊抗兔IgG-异硫氰酸荧光素(上海华美公司)，山羊血清(北京中山生物技术有限公司)；细胞培养箱和恒温摇床(美国Forma公司)，TCS-SP型激光共聚焦显微镜(德国莱卡公司)。
2．工频磁场辐照系统：由1对边长36 cm、高8 cm、168匝的亥姆霍兹(Helmholtz)线圈，1个等长、等高、60匝的中置补偿线圈、2个调压器及细胞培养箱(Model-3164，美国Forma公司)构成，其中3个线圈相互串联后叠放于细胞培养箱中的铁制屏蔽箱内，线圈的2个端线与培养箱外的调压器相连。经德国产WGEFA-2场强计测定，证实3只线圈内的中央区域(10 cm×l0 cm×l0 cm)构成恒温、均匀、强度于0-0.8 mT连续可调的正弦磁场辐照区(磁场分布差异<1％)。
3．噪声磁场辐照系统：由计算机、功率放大器、示波器、细胞培养箱及Helmholtz线圈构成。系统中3只线圈的参数与工频磁场辐照系统中的线圈相同，但用双股铜线平行绕制，并分别与工频磁场及噪声磁场信号连接。实验过程中可以根据需要产生强度连续可调的噪声磁场或与工频磁场叠加的复合磁场。噪声磁场信号源由美国Litovitz实验室提供。
4．细胞培养：中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL，购于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所)培养在有盖玻片的直径30 mm培养皿中，RPMI-1640培养基含15％胎牛血清(FCS)、青霉素(100 kU／L)、链霉素(100 mg/L)、卡那霉素(100 mg/L)，在5％C02、37℃条件下常规培养3 d，换成无血清培养液继续培养12h。
5．分组及处理：将上述细胞分成4组并做不同处理：(1)阳性组：分别用EGFl00μg/L、TNF 10μg/L处理0、5、15和30 min；(2)工频磁场辐照组(MF组)：用0.4 mT工频磁场分别辐照处理0、5、15和30min；(3)噪声磁场组(N组)：用0.4mT噪声磁场分别辐照处理0、5、15和30 min；(4)复合磁场组(MF+N组)：用0.4mT工频磁场与0.4mT噪声磁场叠加的复合磁场分别辐照处理0、5、15和30min。经过不同处理的细胞立即倒去培养液，用0.1 mol／L的磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后，依次用4％多聚甲醛固定、0.2％NP40处理、10％山羊血清封闭、抗EGF或TNF受体抗体处理、异硫氰酸荧光素标记的二抗处理及丙基碘染色处理，每次处理后都用PBS漂洗3-5次，每次5 min，然后取出盖玻片，用90％甘油封片于载玻片上，最后进行激光共聚焦显微镜观察分析。
结果
100μg/L的生长因子EGF及10 μg／L细胞因子TNF作用5min后都能明显诱导细胞膜上相应受体的聚簇，0.4mT、50 Hz工频磁场处理5 min后也可诱导细胞膜上EGF及TNF受体的聚簇，并且都在处理15min时达到最大程度；而等强度的噪声磁场却不能诱导细胞膜受体的聚簇；当等强度的噪声磁场与工频磁场相互叠加形成复合磁场后，工频磁场诱导细胞膜EGF、TNF受体聚簇的效应被抑制。
讨论
细胞膜受体是细胞外激素和细胞因子等配体的作用位点，受体与配体的特异结合是信号转导的起始。配体与相应的受体结合后，通常诱导细胞膜受体的聚簇。因此，受体聚簇是细胞信息传递过程的前提。通常认为，低能量的ELFMF通过细胞膜，经细胞内信息传递途径导致相关基因表达改变，继而引起细胞产生不良效应的外遗传毒性作用，可能是产生不良生物效应的主要机制之一。研究结果表明，ELFMF对细胞内应激活化蛋白激酶(stress- activated protein kinase，SAPK)及P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK)途径有活化作用[6-7]，，能诱导丝裂原活化的蛋白质激酶(Erkl／2)的活性[8]，提示细胞内的信号转导途径参与了工频磁场的生物效应，但电磁场如何活化细胞内信号途径，尤其是信号耦合的位点尚不清楚。一般认为，环境中的电磁场通常因能量较低而难以直接与生物大分子作用或导致DNA损伤，引发突变、畸变及断裂等效应，因而认为电磁场可能通过作用于细胞膜上已存在的信号转导途径，将物理信号转化成生物信号，经过信号转导及生物放大，最终产生生物效应，即细胞膜可能是电磁场生物信号转导的主要起始位点[8]。本质上紫外线与工频磁场同属于电磁波的物理应激因素，可通过细胞膜受体激活细胞内的SAPK途径，表明细胞膜受体是紫外线信号转导的起始位点[9,10]。Bersani等[11]用50Hz脉冲磁场辐照Swiss NIH3T3细胞，发现可明显诱导细胞膜脂质双层中的膜整合蛋白发生聚簇。本研究结果发现，与EGF及TNF类似，0.4mT的工频磁场可以明显诱导细胞膜EGF及TNF受体的聚簇。Beech[12]认为，ELFMF作用于细胞或组织，可诱导细胞表面产生类似的ξ电位，使细胞膜上的粒子沿细胞膜发生微电泳或原位电泳，影响细胞膜上蛋白质的分布状态，导致包括受体在内的细胞膜表面粒子形成微簇，从而产生细胞分裂等效应。工频磁场诱导受体等大分子的聚簇可能与此机制相关。目前虽尚未进一步证实工频磁场诱导的受体聚簇与相应配体诱导的受体聚簇是否具有相同的后续效应，但本实验结果提示，细胞膜受体是电磁场信号耦合的可能位点之一。
细胞内各种离子的不断运动及电位差的存在，已经使机体细胞处在电噪声环境中。为了解释外界的电磁场，甚至是强度比细胞内电磁噪声小许多的电磁场是如何诱导细胞产生生物效应的，Litovitz等首先提出了电磁场空间相干理论[13,15]，并有许多实验从不同研究水平为该理论提供了依据[16]。然而，由于这些研究中所用的磁场强度都很低，其本身的效应尚存在争议，因此，该理论尚未得到广泛接受。
以往的研究表明，0.4mT磁场具有明确的生物效应[6,7,17]。本研究结果也表明，该强度的工频磁场可以较明显诱导受体的聚簇，再次证实了0.4mT工频磁场的生物效应。然而，等强度的噪声磁场却不能诱导受体的聚簇，而且还能在一定程度上抑制工频磁场对受体的聚簇效应，从而用具有明确效应的电磁场强度验证了电磁场的时空相干理论。虽然该理论尚有待于进一步验证和深化，但它为预防ELFMF生物学效应提供了新的思路。hc360慧聪网医疗器械行业频道 慧聪医疗器械 医疗器械 医疗设备 CT B超
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