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补肾益气和血方中药对胚泡着床障碍小鼠子宫内膜表面胞饮突表达的影响

hc360慧聪网医疗器械行业频道 2004-05-25 15:11:47

[摘要] 目的观察补肾益气和血方中药对胚泡着床障碍小鼠子宫内膜表面胞饮突表达的影响。方法选择8-12周龄昆明小鼠，于妊娠第4天(Pd4)晨，皮下注射米非司酮，制成胚泡着床障碍模型。然后将妊娠小鼠随机分为正常组、模型组和治疗组，治疗组从Pdl开始灌服中药(补肾益气和血方)，正常组和模型组则给予等量生理盐水灌服，模型组和治疗组于Pd4晨皮下注射米非司酮，正常组则注射等量生理盐水。采用扫描电镜观察各组小鼠在P舢晚21时30分-22时(第1时间点，T1)和Pd5上午9时30分-10时(第2时间点，T2)，共两个时间点子宫内膜表面胞饮突的表达。结果模型组妊娠率(25％)较正常组(90％)显著降低，差异有显著性(P<0.05)，模型组平均着床胚泡数为(7.7±1.3)个，正常组为(14.7±1.4)个，两组比较，差异有极显著性(P<0.001)；治疗组的妊娠率(55％)及平均着床胚泡数[(12.3±0.8)个]均较模型组显著增加(P<0.05，P<0.01)。T1时正常组子宫内膜表面表达大量发育中的胞饮突，至T2时则表达大量发育完全的胞饮突；T1时模型组子宫内膜发育不同步，胞饮突仅在局部少量表达，至T2时则表达完全消失；T1时治疗组子宫内膜表面表达大量发育中的胞饮突，与正常组相比略延后，至T2时子宫内膜表面表达较多发育完全的胞饮突。结论 T1时胞饮突的表达减少，T2时胞饮突的完全消失，可能是米非司酮导致胚泡着床障碍的原因之一；促进子宫内膜表面胞饮突的表达，可能是补肾益气和血方中药促进子宫内膜接受性的建立和改善胚泡着床的机制之一。 [关键词] 卵植入；补肾益气和血方；子宫内膜胚泡着床正常与否是决定临床上妊娠成功的一个关键因素。在自然受孕状态，大约只有30％的胚泡能够成功着床，而在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，着床成功率就更低，仅为10％-15％左右^[1]，大部分发育良好的胚胎移植入子宫后都被消化吸收，表明在胚泡着床中，子宫内膜的同步发育和接受性至关重要。子宫内膜表面存在大量起源于细胞膜表面的、光滑膜性、足状或蘑菇状突出物，称之为胞饮突(pinopode)^[2，3]。在正常人和动物模型中，胞饮突的数量与胚泡着床间存在正相关关系^[4]。完全发育的胞饮突是评价子宫内膜接受性，以及定位着床窗口期的、最具代表性的形态结构方面的标志之一^[5]。近年来发现，补肾益气和血方中药在临床上用于治疗不孕、不育和辅助治疗IVF-ET患者时，能改善胚泡着床，提高孕育成功率^[6]，为探讨其作用机理，我们制成小鼠胚泡着床障碍模型^[7]，从子宫内膜表面胞饮突表达方面，观察补肾益气和血方中药对胚泡着床障碍小鼠子宫内膜接受性的影响。材料与方法一、动物分组及处理清洁级昆明小鼠(由湖北省卫生防疫站提供)，8-12周龄，体重28-30g，雌、雄小鼠以2：1合笼，次日晨检查阴栓，发现阴栓者记为妊娠第1天(Pdl)。将妊娠雌鼠随机分为正常组、模型组和治疗组，从Pdl开始，治疗组小鼠每日上午灌服中药(补肾益气和血方)0.2ml，正常组和模型组则灌服等量生理盐水。Pd4上午7-8时，模型组和治疗组皮下注射米非司酮注射液0.1 ml，正常组则注射等量生理盐水。每组各3只小鼠分别于Pd4晚21时30分-22时(第1时间点，T1)和Pd5上午9时30分-10时(第2时间点，T2)，在颈部脱臼处死，剖腹取子宫，将一侧宫角固定于4％多聚甲醛中，另一侧宫角纵向剖开，生理盐水充分洗涤，轻轻展平后置2.5％戊二醛中固定。于Pd7各组取20只小鼠处死，观察其妊娠率和着床胚泡数。二、方法 1．药物及试剂：补肾益气和血方由桑寄生、丹参、黄芪、当归、川芎等药物按一定比例组成。该方由同济医院中西医结合研究所采用水煎醇沉工艺制成清膏，每毫升含生药3.75 mg。米非司酮注射液是将米非司酮片(北京第三制药厂生产)研碎后溶于丙二醇中，浓度为0.8mg／ml。 2．组织学观察：固定于4％多聚甲醛中的标本，经常规脱水、石蜡包埋，4 μm连续切片，常规HE染色后，光镜下行组织学观察。 3．扫描电镜观察：固定后的标本，用磷酸盐缓冲液彻底冲洗，系列丙酮脱水，放人2％的乙酸异戊酯中3h，临界点干燥、样本粘贴、涂银胶、喷金，行扫描电镜观察^[2]。三、统计学方法用SPSSll.5统计分析软件，妊娠率采用X²检验，平均着床胚泡数采用t检验进行数据分析，结果以x±s表示。结果一、各组小鼠妊娠率和平均着床胚泡数与正常组比较，模型组妊娠率显著降低(P<0.05)，平均着床胚泡数极显著降低(P<0.001)；治疗组的妊娠率及平均着床胚泡数均较模型组显著增加(P<0.05，P<0.01)，但平均着床胚泡数仍低于正常组(P<0.05)。二、各组小鼠子宫内膜的组织学变化经HE染色，光镜下观察发现，在T1时正常组小鼠子宫腔变小，一端开始闭合，间质明显疏松、水肿，基质细胞增大，尤以腔上皮下基质细胞变化明显，宫腔及腺腔内均充满着丰富的分泌物至T2时，官腔已完全闭合，腺上皮细胞多为单层，宫腔内及腺腔内均充盈着丰富的分泌物，基质细胞明显增生，间质疏松、水肿消失，腔上皮下基质细胞呈蜕膜化变，间质内血管增生明显。在T1时，模型组小鼠子宫腔扩张，间质致密，成纤维样基质细胞密集，至92时，宫腔扩张，腔上皮和腺上皮均明显增生，呈假复层柱状上皮，腺腔轻度扩张弯曲，间质致密，间质中大量成纤维样基质细胞聚集，并有大量巨噬细胞浸润。在T1时，治疗组小鼠子宫腔扩张，一端开始闭合，间质疏松、水肿，腔上皮下基质细胞增生、增大，间质中血管丰富，至T2时，官腔完全闭合，间质中基质细胞增生密集，腔上皮下基质细胞呈蜕膜样变，间质内血管丰富。三、各组小鼠子宫内膜表面胞饮突的表达扫描电镜观察发现，在T1时正常组小鼠子宫内膜表面均匀分布着大量突出于细胞膜表面的膜状突起，大小较一致，界限清楚。此时膜状突起表面不甚光滑，仍有短而细的微绒毛，此即发育中的胞饮突，至T2时正常组小鼠子宫内膜表面胞饮突仍大量而均匀分布，较之T1时突起更加明显，界限更清楚，胞饮突表面因微绒毛的消失而变得光滑，此即完全发育的胞饮突。在T1时，模型组小鼠子宫内膜表面形态表现出不均一性，少量胞饮突呈局灶性表达，且胞饮突的发育不同步，有的明显突出于细胞膜表面，相对较大且彼此间界限清楚，有的刚刚突出于细胞膜表面，相对较小且彼此间界限不甚清楚，大部分内膜表面无膜状突起，覆以浓密的微绒毛，细胞间界限不清，至T2时，模型组小鼠子宫内膜表面胞饮突完全消失，而呈均匀分布的平整的上皮细胞，上皮细胞顶端膜覆以短而细的微绒毛，细胞间界限清楚，表现为增生早期的子宫内膜变化。在T1时，治疗组小鼠子宫内膜表面分布着大量的膜状突起，突起略低于正常组，膜状突起表面有短而细的微绒毛，还可见许多由微绒毛相互融合而构成的小突起，此也为发育中的胞饮突，从形态上看，发育略延后于正常组；在T2时，治疗组小鼠子宫内膜表面表达大量胞饮突，表面光滑，突起更明显，表现为完全发育的胞饮突。讨论一、着床窗口期胞饮突表达的重要性临床上发现胞饮突缺乏的患者，在胚胎植入后发生反复的着床失败，而胞饮突越丰富的患者妊娠率越高^[4]。实验研究发现，在子宫内膜着床窗口期特异表达或升高的整合素ανβ3、肝素结合的表皮生长因子、白血病抑制因子及其受体与胞饮突的消长具有同步性^[8-10]，子宫内膜上皮胞饮突的形成，是子宫内膜接受性建立和着床窗开放的重要形态学标志，并与其他生化方面的标志具有高度的吻合性。二、胞饮突的作用机制尽管胞饮突在胚泡着床中的作用已得到证实，但其具体作用机制还不清楚。目前，有以下几种观点：(1)在小鼠中，胞饮突能介导上皮细胞对液体和大分子物质的摄入，使官腔体积减小而闭合，从而有助于胚泡在子宫内膜的定位，在人体中这种作用还有待证实；(2)胞饮突的形成伴随着子宫内膜上皮细胞间连接的松动，这也许能使胚泡的黏附和穿人更易进行；(3)胞饮突直接参与了胚泡对子宫内膜的黏附，有学者报道，在体外胚泡着床模型中观察到，胚泡黏附在带有胞饮突的上皮细胞上，许多胞饮突恰好在胚泡-子宫内膜细胞交界面完全发育或正在发育，且与滋养外胚层相连，胞饮突光滑的质膜可能能够允许一些对滋养层黏附必须的特异性的受体存在^[11]。三、补肾益气和血方中药对胚泡着床障碍小鼠胞饮突表达的影响本实验在Pd4上午7-8时，经皮下给小鼠注射低剂量米非司酮(此时胚泡已进入宫腔，避开了米非司酮对胚泡发育和运行的影响)，发现其明显降低正常小鼠妊娠率和胚泡着床率，表明米非司酮影响了子宫内膜接受性的建立，导致胚泡着床障碍。补肾益气和血方根据补先天肾气、健后天脾气、调血、和血原理，由桑寄生、丹参、黄芪、当归、川芎按一定比例组成。本研究发现补肾益气和血方中药通过对子宫内膜胞饮突表达的影响，使子宫内膜接受性增强，从而较好地改善胚胎着床率和妊娠率。小鼠子宫内膜着床窗口期是在Pd4下午至Pd5上午，小鼠胚泡一般在Pd4晚22-24时开始着床。为了更好地了解着床窗口期间子宫内膜接受性的建立情况，我们选择在Pd4晚21时30分-22时和Pd5上午9时30分-10时两个时间点观察子宫内膜胞饮突的表达。Pd4晚正常小鼠子宫内膜表面存在大量发育中的胞饮突，至Pd5上午，胞饮突发育完全。所以在本次实验中我们观察到小鼠子宫内膜胞饮突的完全发育是在Pd5的上午。Pd4晨给予妊娠小鼠米非司酮后，至Pd4晚胞饮突的表达已明显被抑制，至Pd5上午这种作用越发明显，胞饮突的表达已完全被抑制。给予胚泡着床障碍小鼠补肾益气和血方中药后，Pd4晚子宫内膜表面可见大量发育中的胞饮突，发育较正常略延后，至Pd.5上午，可见发育完全的胞饮突，表明补肾益气和血方中药能明显改善胚泡着床障碍小鼠子宫内膜表面胞饮突的表达，有助于子宫内膜接受性的建立，从而最终改善胚泡着床。控制子宫内膜接受性的雌、孕激素，同样控制着胞饮突的表达，胞饮突的发育依赖孕激素，雌激素则限制其发育，两者共同调节胞饮突的发育和萎缩^[12]。围着床期黄体功能低下所致的孕激素分泌不足、促排卵或超排卵使雌激素分泌过高等内分泌紊乱，都会影响子宫内膜表面胞饮突的表达和子宫内膜接受性的建立。子宫内膜接受性差、胚泡着床率低已成为限制临床各种助孕技术发展的一个瓶颈。祖国医学博大精深，发掘祖国传统医学，寻求能有效改善胚泡着床而又无胚胎毒性的中药或复方制剂是现代医学结合传统医学研究的新方向，本实验研究的补肾益气和血方在此方面作了一个很好的探索。
信息来源：黄冬梅黄光英陆付耳


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