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激光共聚焦显微镜对肝组织纤维化程度的荧光定量分析
hc360慧聪网医疗器械行业频道 2003-09-09 15:31:18
    目前对肝组织纤维化程度的定量分析尚无有效方法。我们以间接免疫荧光组织化学染色配合激光共聚焦显微镜扫描定量分析肝组织I、Ⅲ型胶原、转化生长因子(TGF)-B1的表达变化，探讨肝组织纤维化程度定量分析的可行性。

    一、材料与方法
    1、研究对象：对21例慢性乙型肝炎、肝硬化病人参照中华医学会传染病与寄生虫病分会，肝病学分会2000年9月修订的诊断标准明确诊断。正常对照为肾移植手术的健康供肾人，共3例。
    2、研究方法：取上述病人清晨空腹血用放射免疫法联合检测血清肝纤维化指标透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)。检测试剂盒购自上海海研医学生物技术中心。
    经病人同意后，以16GMenghini肝穿刺针行肝穿刺活检术，肝组织行HE染色。正常肝组织在取肾时同时获取。由病理科医师参照中华医学会传染病与寄生虫病分会，肝病学分会修订的肝组织G-S分期诊断标准，进行肝组织G-S分期并进行半定量记分，记分方法采用王泰龄等的方法。
    上述石蜡切片行肝组织I、Ⅲ型胶原、TGF-8l的间接免疫荧光组织化学染色，配合激光共聚焦显微镜扫描，进行肝组织I、Ⅲ型胶原、TGF-p1的荧光定量分析。肝组织间接免疫荧光组化染色的操作步骤：
    I、Ⅲ型胶原染色：①肝组织蜡块在超薄切片机上切为厚4ltm的薄片，挂片烤干后，常规脱蜡、水化、脱水、透明；②蒸馏水冲洗2 min×3次，PBS浸泡5 min；③0.4％胃蛋白酶盐酸溶液(0.01mol／LHCl，pH=3)37℃抗原修复30min；④蒸馏水冲洗2min×2次，PBS冲洗2min×2次，擦去样品周围液体；⑤10％正常山羊血清(0.01 mol／LPBS稀释)封闭，室温孵育30min，倾去血清，勿洗；⑥滴加混合的鼠抗人I型胶原和兔抗人Ⅲ型胶原一抗(均购自美国Sigma公司，0.01mol／LPBS稀释，最终稀释浓度为1：100)，4℃过夜；⑦PBS冲洗5min×3次；⑧滴加混合好的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔二抗(购自美国Sigma公司)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的羊抗鼠二抗(购自美国Jackson公司)。上述二抗均用0.01 mol／LPBS稀释，混合后最终稀释浓度为1：100。室温反应2 h；⑨PBS冲洗5 min× 3次。90％甘油封片。
    TGF-13l染色：①、②步同上；③石蜡切片置于微波炉中95℃微波抗原热修复30 min；④蒸馏水冲洗2 min×2次，PBS冲洗2 min×2次；擦去样品周围液体；⑤10％正常山羊血清(0.01 mol／LPBS稀释)封闭，室温孵育30 min，倾去血清，勿洗；⑥滴加鼠抗人TGV-B1的＝抗(购自美国Santa Crus公司，0.01 mol／LPBS稀释，稀释浓度为1：50)，4℃过夜；⑦PBS冲洗，5min× 3次；⑧滴加FITC标记的羊抗鼠二抗(购自美国Sigma公司，0.01 mol／L PBS稀释，稀释浓度为1：50)，室温反应2 h；⑨PBS冲洗，5 min× 3次。90％甘油封片。

    激光共聚焦显微镜扫描分析：以Zeiss510 LSM激光共聚焦显微镜检测工、Ⅲ型胶原、TGF-131的荧光定星表达。Ⅰ、Ⅲ型胶原以红绿双色荧光通道扫描观察。绿色荧光的激发波长为488 nm，在530nm波长以上观察。红色荧光的激发波长为543 nm，在560 nm波长以上观察。TGF-8，采用单一绿色荧光通道观察，激发波长为488nm，在530nrn波长以上扫描观察。每张切片选取荧光表达最强的10个视野观察并由计算机自带扫描分析软件测定荧光强度与面积。上述指标的荧光值二平均荧光强度X平均荧光面积。

    3、统计分析：以上数据均以x±s表示，统计方法采用直线相关分析与pearson列联相关分析，由SPSS 10.0统计软件分析。

    二、结果
    1、肝组织I、Ⅲ型胶原的荧光表达：经FITC染色，Ⅲ型胶原阳性表达为绿色荧光；经TRITC染色，I型胶原阳性表达为红色荧光。在慢性肝炎、肝硬化病人，I、Ⅲ型胶原的表达大量增加，在汇管区、血管壁周围、炎性坏死区，均可以看见I、Ⅲ胶原的大量表达，并向肝小叶内延伸，分隔包绕肝小叶。
    2、肝组织TGF-p1的荧光表达：经FITC染色，TGF-p，的阳性表达为绿色荧光。在慢性肝炎、肝硬化病人的肝组织间质、肝细胞的细胞质和细胞膜，TGF-p1均有强弱不等的表达，在汇管区、炎性坏死区、纤维增生集中、假小叶形成的区域，TGF-Bl强烈表达。
    3、肝组织I、Ⅲ型胶原、TGF-fil表达的荧光定量与G-S分期积分、血清肝纤维化指标的相关分析。

    讨论  I、Ⅲ型胶原是肝组织间质的主要组成成分，约占肝组织间质的80％以上。在慢性肝炎、肝硬化时，I、Ⅲ型胶原同时上升，其中以I型胶原在肝纤维化后期上升尤为明显，I／III达到2～3：1。TGF-BI，可促进肝星形细胞(HSC)由静息型向活化型转化，并促进静息型HSC的进一步激活，从而启动肝纤维化进程。此外，TGF-13l还能抑制胶原溶解酶的表达，促进组织型金属蛋白酶抑制剂的合成，进而阻止胶原降解，增加胶原沉积，加速肝纤维化进程。肝组织I、Ⅲ型胶原、TGF-B，的表达可从不同侧面反映肝纤维化的程度。如果能对上述指标进行联合定量分析，就能比较全面对肝组织纤维化程度进行定量分析，了解肝组织纤维化的程度。这对慢性肝病的治疗效果、预后评估都有很好的指导意义。但遗憾的是，目前对肝纤维化的评估方法以免疫组化病理图像半定量分析居多，尚少见对肝组织纤维化程度进行的定量分析报道。

    激光共聚焦显微镜是近年来发展起来的一种结合激光扫描、计算机自动化分析与显微镜技术的新技术，新仪器。它使用计算机自动定量分析被激光管扫描的物体所激发出的荧光数量的变化，具有图像清晰，特异性高、敏感性强，可精确定量等优点。本研究应用间接免疫荧光组织化学染色后，肝组织I、Ⅲ型胶原、TGF-p1被分别标记上荧光素。不同波长的荧光素被激光共聚焦显微镜上的激光管激发后，荧光数量的变化可以被激光共聚焦显微镜自带的计算机分析软件采分析，从而准确定量反映肝组织上述指标各自表达的变化。如研究所示，肝组织的I、Ⅲ型胶原、TGF-8l的荧光定量与病人肝组织G-S分期半定量积分、血清肝纤维化指标均呈显著相关性。因此，上述指标的荧光定量分析，能准确的量化反映肝组织纤维化的程度。

    与病理图像半定量分析相比，激光共聚焦显微镜具有以下优点：①更精细、精确度更高：激光共聚焦显微镜行间接免疫荧光组化染色并做定量分析，利用激光聚焦，荧光标记和系统软件分析对组织进行深层扫描，不破坏组织细胞结构，可准确深层次定位和精确定量。与病理图像分析以光灰度的差别变化进行半定量分析相比，在科研上具有极大优势。②激光共聚焦显微镜一般都有2个以上不同波长的激光管，因此只要将标本标记上不同波长的荧光，就可以在同一张切片上同时分析2种或更多不同指标的变化，并比较它们之间的比值变化，方便而精确，这一点是病理图像分析无法比拟的。③激光共聚焦显微镜可根据科研需要，提供纯荧光、白光以及荧光与白光合成图像等多种图像，这一点也优于病理图像分析。④以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本，如用石蜡切片做免疫荧光染色，在普通荧光显微镜下，常因背景非特异性荧光过强而影响观察结果。但如用激光共聚焦显微镜扫描石蜡切片的荧光染色，因为激光的激发波长非常特异，则可较好地避免上述情况的发生，获得清晰的图像，这也是激光共聚焦显微镜的一大优点。石蜡标本来源广泛，因而本方法也适用于回顾性研究。
信息来源： 宋怀宇 赵启韬 王万忠
 
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